氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全。酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法。从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌。通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析分离纯化,得到了氨基甲酸乙酯水解酶纯酶。SDS-PAGE电泳图显示,该酶亚基分子量约为50 k Da。该酶最适反应温度为35℃,最适p H值为7.0,在10~45℃时,具有良好的热稳定性。以氨基甲酸乙酯为底物反应,其Km和Kcat分别为37.2 mmol/L和1 176.4 s-1。金属离子显著抑制酶活力,而EDTA对酶活力无影响,表明此酶为非金属酶。此外,该酶对低浓度的Na Cl和乙醇有一定的耐受性,具有在酱油和黄酒中去除氨基甲酸乙酯的应用潜力。     

蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质测定

大蒜中功能成分含硫化合物是由蒜氨酸酶(alliinase,E C4.4.1.4)催化蒜氨酸(alliin)生成的。本实验通过提取、盐析、透析及层析,自新鲜大蒜中分离纯化出蒜氨酸酶,并测定了蒜氨酸酶的酶学性质。蒜氨酸酶的适宜分离纯化过程及条件为:pH7.0Na /K 磷酸缓冲液提取,45%饱和度NH4(SO4)2盐析,10000×g离心沉淀30min,pH6.5的Na /K 磷酸缓冲液溶解,截留1.4万分子量透析袋透析,Sephadex G-200层析,收集洗脱时间4.75h的洗脱液。蒜氨酸酶最适温度和pH值分别为30℃和6.3,Mg2 、Zn2 、Fe2 、Fe3 、EDTA-Na金属离子对蒜氨酸酶有激活作用,Fe3 激活作用最明显,Cu2 严重抑制蒜氨酸酶活性。以合成S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为5.91mmol/L、Vmax为1.55μmol/min。     

假丝酵母氨基甲酸乙酯水解酶的分子克隆及酶学性质

氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物.生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯.该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达.实验结果表明,cpUH基因大小为1656 bp,编码552个氨基酸;重组蛋白大小约为60...     

红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

以红佳酿酿酒酵母为出发菌株,通过离子交换法分离纯化β-葡萄糖苷酶,测定酶活力和蛋白质含量,并研究温度、pH值稳定性和金属离子、葡萄糖、酒精度对酶活力的影响。结果表明:粗酶液经过离子交换层析后,纯化倍数为19.41,得率为38.67%;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳检测为1条谱带,达到电泳纯,分子质量约为45 kD;β-葡萄糖苷酶热稳定性较差,在20~40℃较稳定,在pH 5.0~10.0较稳定;Al3+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+对酶活力的影响不明显;葡萄糖和酒精对酶活力无明显抑制作用。     

香葱中蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质

对香葱中蒜氨酸酶进行分离纯化并研究其酶学性质。通过均浆、离心、硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析和Sephadex G200凝胶过滤层析技术分离纯化得到纯度较高的蒜氨酸酶,并利用SDS-PAGE电泳对其纯度进行鉴定。结果表明,经分离纯化可得纯化倍数为19.6倍的蒜氨酸酶,酶比活力为11.44U/mg,酶活回收率为32.1%,达到电泳纯,其亚基的分子质量约为54.5ku。纯酶的最适反应温度为45℃,最适pH7.0,以S-甲基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为45.31mmol/L,Vmax为40.32μmol/(mg·min)。     

马克斯克鲁维酵母菊粉酶的分离纯化和酶学性质研究

马克斯克鲁维酵母产生的孢外菊粉酶经超滤浓缩、DEAE-Cellulose阴离子交换色谱、SephadexG-100凝胶色谱分离纯化,得到两个菊粉酶组分ExoⅠ和ExoⅡ,I/S值分别为0.0249和0.0253,均属外切菊粉酶。ExoⅠ经聚丙烯酰胺凝胶鉴定为均一组分,分子量为85kD。ExoⅠ最适pH值为4.0,最适温度为60℃,Mn2+和Mg2+对酶活力有促进作用,而Cu2+、Fe2+对酶活力有抑制作用,ExoⅠ水解菊粉溶液的产物为果糖和少量葡萄糖。     

低温脂肪酶的分离纯化及酶学性质

苏云金芽胞杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为75.5倍,活性回收率为37.6%,12%SDS-PAGE电泳估计其相对分子质量约40 000。对纯化后的脂肪酶进行酶性质研究表明:酶的最适作用温度为25℃,对热敏感,60℃处理30 min仅残留30%酶活性;酶的适宜作用pH范围在7～9,最适pH为8;该脂肪酶的水解活性对Ca2+表现明显的依赖性,Al3+、Zn2+和Fe2+对脂肪酶有显著的抑制作用;脂肪酶对醇类有机溶剂的耐受性随碳链增加而减小;脂肪酶对豆油表现出显著的特异性,而蓖麻油抑制脂肪酶水解活力。     

降解β-胡萝卜素双加氧酶的分离纯化及其部分酶学性质

研究了西方许旺酵母菌发酵产生双加氧酶的分离纯化及其酶学特性,并利用该酶降解β-胡萝卜素生成香味物质。通过摇瓶发酵,并对粗酶液进行硫酸铵梯度沉淀、半透膜透析、DEAE-Sepharose离子交换和Sephadax G-100凝胶过滤等处理,得到转化β-胡萝卜素生成香气物质的双加氧酶。实验结果表明,西方许旺酵母菌发酵产生的双加氧酶被纯化了36.43倍,酶活力回收率为21.0%,分子量为55.0 ku。酶的最适温度为40℃,最适p H为8.5;金属离子对降解β-胡萝卜素双加氧酶活力的影响为:Fe²⁺>Mg²⁺>K⁺>Na⁺>Mn²⁺>Cu²⁺>Ca²⁺>Zn²⁺>Ag⁺。Fe²⁺和Mg²⁺能明显增强酶活力,而Zn²⁺和Ag⁺能抑制酶活力;SDS和胃酶抑素对酶活力有显著抑制作用。降解β-胡萝卜素双加氧酶的K_m=8.24×10^-4mol/L,V_max=2.16×10^-4mol/（min·mg）。      

草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

草菇(Volvariellavolvacea)在20L发酵罐中以稻草粉为基质进行培养,所产生的β 木糖苷酶(β 1,4 xylosidase,EC3.2.1.37)经硫酸铵沉淀、苯基 琼脂糖(Phenyl agarose)疏水性柱层析、DEAE Sephacel阴离子柱层析、TOSOHASS HW 5S分子筛过滤分离等提纯步骤,达到了电泳纯,提纯倍数为241倍,收率为14.5%.该酶反应的最适pH值为6.41～6.76,最适温度为55℃;在pH值5.78～7.68之间酶活力相对稳定,52℃的半衰期(t1/2)为1h.由凝胶过滤和SDS PAGE测得酶由4个亚基组成,酶的相对分子质量为2825000.在所测定的底物中,β 木糖苷酶仅对对硝基苯基 β D 木糖苷有专一性水解作用,其对对硝基苯基 β D 木糖苷水解的动力学参数Km值为2.4mmol/L,vmax为42μmol/(min·mg).该酶催化对硝基苯基 β 木糖苷水解将产物β 木糖反转成α 木糖.     

黑木耳酪氨酸酶的分离纯化与酶学性质研究

本文分离纯化了黑木耳酪氨酸酶,并对酶学性质进行了研究。采用经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100和DEAE-Sepharose-FF柱层析对粗酶液进行分离纯化,得到电泳纯的黑木耳酪氨酸酶,比活力提高了21.43倍,酶活回收率为27.41%。该酶的酶学性质研究表明:蛋白亚基分子量为12.62ku;最适pH7.0,在中性和碱性条件下稳定;最适温度为40℃,50℃以下温度条件较为稳定;以酪氨酸为底物,米氏常数K m为5.88mmol/L,V max为64.10μmol/min。实验结果表明黑木耳酪氨酸酶具有其它酪氨酸酶相似的酶学特性。      

黑曲霉降酸菌株F1降解酒石酸关键酶的分离纯化

为得到黑曲霉菌株F1中具有降酸作用的蛋白,将黑曲霉菌株F1经酒石酸诱导发酵得到菌丝体,用液氮研磨破碎细胞壁,超声波辅助提取得到粗酶液,硫酸鱼精蛋白去除核酸,热变除杂蛋白,聚乙二醇浓缩,透析脱盐,DEAE-纤维素52阴离子交换层析,Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱分子筛层析,最终得到该蛋白的单一组分,其纯化倍数为14.32,并确定该酶为脱氢酶类。     

蜜桔果酒用非酿酒酵母的分离鉴定、发酵特性及挥发性香气成分分析

目的:获得适合蜜桔果酒发酵的非酿酒酵母。方法:从南丰蜜桔自然发酵液中分离产香酵母菌,经26S rDNA序列分析来鉴定菌株。根据单菌发酵后蜜桔酒的残糖、乙醇、总酸、pH来筛选发酵能力较好的菌株,采用顶空气相色谱质谱(headspace-gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-MS)分析蜜桔果酒香气成分。结果:一共分离出7株产香酵母,鉴定为Pichia fermentans、Pichia aff. fermentans、Pichia kluyveri、Hanseniaspora guilliermondii、Hanseniaspora opuntiae、Hanseniaspora thailandica、Candida ethanolica。其中,C. ethanolica具有较好的蜜桔酒发酵性能,发酵后果酒残糖为1.2 g/L,乙醇为8.9%;H. thailandica是一株发酵蜜桔果酒产香能力较好的菌株,能够产生较少的杂醇和挥发性酸和丰富的酯类物质,包括乙酸乙酯、羊蜡酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、丙酸乙酯、乳酸乙酯等,能够减弱尖酸味,协调苦涩味,令酒香醇厚,并且具有较好的感官评分。结论:本研究得到一株具有较好的蜜桔果酒发酵性能的酵母菌C. ethanolica,和一株产香能力较好的酵母菌H. thailandica,为后续混合发酵改善蜜桔果酒风味提供研究基础。     

Isolation, Purification, and Characterization of Lipase Isoenzymes from a Technical Aspergillus niger Enzyme

A qualitative screening revealed the occurrence of lipase, esterase, protease, amylase, endo-1,4-β-D-glucanase, xylanase, pectinmethylesterase, polygalacturonase, catalase, β-D-glucosidase and β-D-galactosidase activities in the technical Aspergillus niger enzyme under study (Lipase 2212 D, Röhm). The isolation and purification of lipolytic activities were performed by combination of DEAE-Trisacryl M ion exchange chromatography, Sephadex G 50 gel filtration and hydrophobic chromatography using Phenylsepharose CL-4B. The individual purification steps were checked by specific enzyme visualization in ultrathin agar gels after ultrathin-layer isoelectric focusing (UIEF). Two UIEF homogeneous lipase isoenzymes (I and II) were isolated and characterized by the following parameters: isoelectric points (I: 4.0; II. 3.5); molecular weights (I: 31000 daltons; II: 19000 daltons); carbohydrate contents (I: 6%; II: 9%) and compositions; pH optima (I, II: 5-6); substrate specificities and various effectors.     

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质虾青素β-胡萝卜素角黄质β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al~(3+)和Fe~(3+)是该酶的强效催化剂,Fe~(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。     

氨基甲酸乙酯降解菌株的分离鉴定及其在白酒中的应用

氨基甲酸乙酯(EC)是发酵食品和酒精饮料在生产和贮藏过程中形成的有害代谢产物,具有遗传毒性和较强的致癌性。发酵食品中EC含量的控制是食品安全研究领域的重点议题。本研究以醋醅、酒糟为研究对象,以EC为唯一碳源,从醋醅、酒糟中分离具有EC降解能力的菌株,共获得48株EC降解菌株,经鉴定为14个种属,包括乙醇假丝酵母、大仁红酵母、戴尔福特菌、耐久肠球菌、芽胞杆菌、屎肠球菌等。将分离获得的纺缍形赖氨酸芽孢杆菌和乙醇假丝酵母包埋固定后,分别应用于白酒中EC的去除,结果表明,两个处理组白酒中EC浓度在12 h由230.37 μg/L降至78.12 μg/L(纺缍形赖氨酸芽孢杆菌)和86.97 μg/L(乙醇假丝酵母),EC降解率分别为66.09%和62.25%。本研究结果可为挖掘耐酸、耐乙醇的氨基甲酸乙酯降解菌株提供参考。     

蓝靛果酒带渣发酵工艺的优化及其香气分析

以冷冻蓝靛果为原料,对蓝靛果发酵的工艺进行优化,筛选适合的澄清剂,并对成品中的香气成分进行分析。研究酵母添加量、初始糖度、初始pH、发酵温度对蓝靛果酒发酵过程中的总酸、残糖量及酒精度的影响,在单因素的基础上进行四因素三水平的响应面优化。结果表明,蓝靛果酒最佳的发酵工艺参数为初始糖度20 °Bx,初始pH3.5,发酵温度18℃,酵母添加量3.5%(w/w),在此工艺下蓝靛果酒感官评分91分;通过果胶酶、壳聚糖、明胶、CMC四种澄清剂对蓝靛果酒澄清作用的分析,最适澄清剂为2%(v/v)CMC,明胶相对最弱;通过GC-MS进行分析成品果酒的香气成分,得到蓝靛果酒香气的主要成分为丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇、甲酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基-1-丁醇。产品具有浓郁的果香和酒香,口感清冽爽口,具有典型的果酒特色。     

黄瓜过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

新鲜的黄瓜经匀浆、抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶。该酶的比活力、回收率及纯化倍数分别为64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。该酶的分子质量为41.15 kD,亚基分子质量为40.21 kD。该酶的最适温度和最适pH值分别为60 ℃和6。在25～45 ℃及pH 5～9的范围内非常的稳定。在测定条件下测得该酶的Km值为53.79 mmol/L。硫氰化钾对该酶活力基本无影响。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+对该酶都具有激活作用且浓度至50 mmol/L时酶活力分别被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%,然而十二烷基磺酸钠、抗坏血酸和草酸对该酶有强烈的抑制作用;Zn2+、甲醇、乙醇和异丙醇对该酶有一定的抑制作用。     

球毛壳菌α-葡聚糖酶的异源表达、纯化及特性表征

利用毕赤酵母密码子偏好性优化合成球毛壳菌α-葡聚糖酶基因,并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。通过高拷贝筛选和摇瓶发酵条件的单因素优化,重组α-葡聚糖酶的酶活力由初始的2.692 U/mL提高至47.915 U/mL。选择 Hitrap Q HP 和Hitrap SP HP 的双步层析分离将发酵粗酶液纯化至电泳纯,纯化倍数40.83,比活达277.61 U/mg,回收率为24.15%。纯酶最适温度和pH分别为60 ℃和5.5。在20~50 ℃和pH为4.5~8.5范围内稳定性良好,浓度为10 mmol/L的Fe²⁺对酶有激活作用,Cu²⁺浓度（0.1~10 mmol/L）越高对酶的抑制作用越强。酶动力学实验发现该重组酶对高相对分子质量的底物亲和力更高,葡聚糖T2000为该酶的最适底物。     

韭菜过氧化物酶的分离纯化及性质

经匀浆、抽提、硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的韭菜过氧化物酶(POD)。该酶比活力达到14031.41U/mg,纯化倍数为102.96,回收率为10.85%。该酶分子质量约为28.4kD,最适温度40℃、最适pH值为4.6。该酶在20～40℃以及pH 4.0～8.0有较好的稳定性,在最适条件下测得其Km值为18.15mmol/L。低浓度草酸、Zn2+、Mg2+等对该酶有较强激活作用;甲醇、乙醇、异丙醇、SDS、抗坏血酸(AsA)以及Mn2+、Fe3+等对该酶有较强的抑制作用。     

鹰嘴豆多糖分离纯化和结构表征

以鹰嘴豆为原料,对其全豆、子叶、种皮等不同部位多糖分布和理化性质进行分析、比较,并研究鹰嘴豆种皮多糖(Cicer arietinum hull polysaccharide,CAHP)结构特征。根据得率和化学组成等结果,可推测鹰嘴豆多糖集中分布于其种皮部位;进一步采用柱层析分离法对CAHP纯化获得6个组分,并对其中得率较高且具有良好均一性的多糖组分CAHP-F_0.2进行结构表征。结果表明,CAHP-F_0.2以HG型果胶多糖为主,其主链由1,4-Galp A连接而成,并含有少量的RG-I型果胶结构域,同时存在阿拉伯聚糖侧链和阿拉伯半乳聚糖-II侧链。本研究将为鹰嘴豆多糖结构、生物活性研究和资源开发提供一定理论依据。