蓝圆鲹肌肉中丝氨酸蛋白酶的分离纯化及性质研究

鱼类死后肌肉容易发生软化现象。研究表明,这与肌肉中的丝氨酸蛋白酶有着密切的关系。本研究通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel、Q-Sepharose及Capto Q等柱层析相结合的方法,从蓝圆鲹肌肉中纯化得到一种具有分解明胶能力的丝氨酸蛋白酶,SDS-PAGE结果显示其分子量约为60ku,该酶最适温度及最适pH分别为40℃和9.0。丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc SC、Benzamidine、MBTI、PMSF和LBTI均能明显的抑制该酶的活性,而其他蛋白酶抑制剂对其活性没有明显的影响。底物特异性表明其能有效的降解丝氨酸蛋白酶荧光底物Boc-Leu-Lys-Arg-MCA,但进一步研究发现,该酶对I型胶原蛋白及明胶有明显的分解能力,同时对肌球蛋白重链也有一定的分解作用,说明该酶可能参与鱼肉保鲜中肌肉软化的过程。     

基于内源酶活性变化的冷藏哈氏仿对虾肌肉品质研究

目的：探究冷藏条件下哈氏仿对虾内源酶活性及肌肉品质特性的变化情况。方法：以哈氏仿对虾为对象,在0℃冷藏0、2、4、6 d,比较分析完整虾组和去头虾组肌肉的质构、TCA-可溶性肽、肌原纤维蛋白含量及其小片化指数以及虾头与肌肉中各种内源酶活性的变化规律。结果：随着冷藏时间的延长,两组虾肌肉中TCA-可溶性肽含量及肌原纤维小片化指数均呈现上升趋势;肌原纤维蛋白含量呈下降趋势,完整虾组和去头虾组肌肉在冷藏6 d后分别降低了56.65%和44.63%;而两组虾肉的硬度和弹性也始终呈现出下降趋势。在冷藏过程中,完整虾组虾头中胰蛋白酶活性逐渐下降,而其肌肉中活性则不断增加,去头虾组肌肉中该酶活缓慢下降,完整虾组虾头及肌肉、去头虾组肌肉中分别变化了16.9%、68.8%和15.2%;钙蛋白酶活性在两组肌肉中均随冷藏时间延长而不断下降,其中以完整虾组肌肉下降幅度较明显;在冷藏过程中组织蛋白酶B、D、H及L活性变化情况有所不同,其中去头虾组肌肉中4种组织蛋白酶活性整体高于完整虾组;两组虾肌肉中4种组织蛋白酶的活性在各亚细胞组份中,随着冷藏时间延长而逐渐下降,且完整虾组中活性高于去头虾组。结论：在冷藏过程中...     

低温无水保活对虾夷扇贝肌肉质构和肝脏生化特性的影响

为探讨低温无水保活对虾夷扇贝肌肉质构和肝脏生理生化特性的影响,分析了不同保活条件下虾夷扇贝的存活率,研究了无水保活前、保活过程中(24、48、72、96 h)和复水后(4、8 h)虾夷扇贝的肌肉质构特性、乳酸脱氢酶(LDH)活性、糖原(Glc)质量比及肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷草转氨酶(G...     

表面活性剂稳定性碱性蛋白酶纯化及性质研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XG12发酵液中分离纯化表面活性剂稳定性碱性蛋白酶,并对酶学性质进行研究。利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析等方法,分离纯化到了均一的酶蛋白,酶纯度提高了42.6倍,回收率为25.3%。SDS-PAGE及Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析显示酶蛋白为单亚基蛋白,分子质量约为29.5kD。在pH7.0～11.0范围内酶活性及稳定性较高,最适作用pH值为10.0,最适作用温度40℃。Mg2+、Ca2+及Mn2+对酶有明显激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂强烈抑制酶活性,表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。酶分别对终质量浓度为0.1g/100mL的阴离子表面活性剂SDS、阳离子表面活性剂CTAB和体积分数为1%的非离子型表面活性剂Tween-80、Tween-20、Triton X-100以及氧化剂均具有很强的稳定性。     

雅致放射毛霉3.2778羧肽酶性质及其活性中心结构的研究

固态发酵雅致放射毛霉菌株(Actinomucor elegans)3.2778得到羧肽酶粗酶液,以N-苄氧羰酰基-L-苯丙胺酰-L-亮氨酸(N-CBZ-Phe-Leu)为底物,采用镉-茚三酮法测定羧肽酶水解产物。结果表明:雅致放射毛霉3.2778羧肽酶最适作用pH值范围为6.5～7.2,最适作用温度范围在40℃～45℃,最适作用温度为40℃,在30℃～40℃具有良好的温度稳定性。0.99mmol/L金属离子中,Mg2+对羧肽酶活力表现出显著的促进作用,酶活提高37%;而Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+可以抑制绝大部分酶活,残留的相对酶活力约10%。9.1mmol/L金属蛋白酶抑制剂1,10-邻菲啰啉(OP)和丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和二异丙基磷酰氟(DFP)均可以完全抑制该酶活性,同时,对巯基有修饰作用的蛋白酶抑制剂PCMB、DTT、碘乙酸和β-巯基乙醇对羧肽酶有强烈的抑制作用。因此,推断该酶可能是一种丝氨酸羧肽酶,其活性中心有丝氨酸残基和二硫键结构,酶活受Mg2+激活。     

响应面优化虾夷扇贝抗氧化肽酶解液工艺研究

为制备富含抗氧化肽的扇贝酶解液,以虾夷扇贝为原料,以水解度和DPPH自由基清除率为指标,应用响应面法优化扇贝蛋白的生物酶解工艺,并测定了富含活性肽酶解液的体外抗氧化性。结果表明:扇贝蛋白生物酶解适宜工艺参数为蛋白酶用量3.1%,酶作用温度45℃,作用时间4.5 h,此工艺参数下酶解液DPPH自由基清除率为82.06%,总抗氧化能力为0.11 U/mg prot,抗超氧阴离子活力为0.37 U/g prot,羟自由基清除率为55.31%。     

嗜热芽孢杆菌蛋白酶HS08的分离纯化研究

从高温土壤中分离得到的一株产耐热中性蛋白酶的嗜热芽孢杆菌,该菌分泌的胞外蛋白酶粗酶液经80%饱和度硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdax75凝胶层析分离纯化后,纯化倍数提高4．36倍,得率为5．3%,经SDS-PAGE电泳测得其分子量为30．6kDa。酶的最适温度与pH实验表明,该酶最适温度为65℃、最适pH为7．5,并且该酶在50℃时表现出1h以上的稳定性。该蛋白酶的活性受到丝氨酸族蛋白酶专一性抑制PMSF和金属离子螯合剂EDTA强烈抑制,Zn2+能提高酶活性,因此该蛋白酶为Zn2+激活的丝氨酸族蛋白酶。     

章鱼肠道产蛋白酶菌的筛选、产酶条件及酶学性质

采用检测水解透明圈和测定蛋白酶活力的方法,从章鱼肠道中分离筛选出一株高产蛋白酶的菌株QDV-3,并对其产酶条件及酶学性质进行研究。结果表明:QDV-3菌株在以果糖为碳源,蛋白胨为氮源,培养基初始pH8.0,培养温度30℃的条件下振荡培养3.5d时,所产蛋白酶活力最高,Mn2+和Ba2+对菌株产蛋白酶有促进作用。所产蛋白酶在SDS-PAGE电泳上显示至少有5种蛋白酶,分子质量范围为32.4～124.2kD,蛋白酶的最适作用温度为50～60℃,最适作用pH值为9～11,在50℃条件下保温1h,剩余酶活力为95%,热稳定性较好。     

扇贝酶解条件的优化及其抗氧化性的研究

以海湾扇贝和虾夷扇贝为原料,研究了扇贝品种、蛋白酶种类、加酶量、酶解温度、酶解时间、固液比对水解度和DPPH自由基清除率的影响。在单因素试验的基础上,采用响应面法对酶解条件进行优化。结果表明:以海湾扇贝为原料,用中性蛋白酶进行水解效果较好,酶解时间4h,温度40℃,加酶量1.0%。在优化条件下进行试验,得到DPPH自由基清除率为81.76%,与预测值的相对误差为0.45%,预测模型与实际情况拟合良好。在优化条件下对扇贝酶解液的羟自由基清除率、总抗氧化活力和抗超氧阴离子活力进行了测定,得出海湾扇贝总抗氧化能力为0.11U/mg prot,抗超氧阴离子活力为0.37U/g prot,羟自由基清除率为55.31%。     

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

福寿螺纤溶活性蛋白的纯化及性质研究

通过硫酸铵分段沉淀、DEAE-32纤维素柱和SephadexG-75柱层析,从福寿螺(Ampullarum crossean)体内分离纯化出一种相对分子质量约为40kDa的纤溶活性蛋白,紫外光谱法测定表明,该蛋白具有纤溶作用,经SDS-PAGE电泳显示为一条带.研究表明,该蛋白作用最适pH为8.0,最适温度为59℃,热稳定性较好,金属离子Na+对酶的活力无影响,而K+、Mg2+、Ca2+可提高此蛋白酶的活力.采用平板法测定此蛋白酶的血纤维蛋白溶解活性,证明此酶具有强烈的纤溶活性.     

海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自连云港海域的海洋细菌(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)菌株产蛋白酶的条件及酶学性质进行研究。结果表明,在发酵温度为20℃、培养基pH 值为8.0、NaCl 质量浓度为20g/L、接种量2.5% 和装液量20% 时产酶较高。甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鱼粉和酵母粉有利于蛋白酶的产生。该酶的最适作用温度为35℃,0℃时相对酶活力达21.7%。45℃条件下保温60min 后酶活力仍能保持80% 以上。酶的最适作用pH 值为10.0,pH 值为7.0～11.0 范围为时,酶活力相对比较高。酶在pH8.0～11.0 范围内稳定,最稳定的pH 值为10.0,属于低温碱性蛋白酶,Mn2+、Cu2+、Ca2+ 对其具有较强的激活作用,Hg2+ 较强地抑制其酶活力。苯甲基磺酰氟(PMSF)能完全抑制该蛋白酶,EDTA 无影响表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。     

地衣芽孢杆菌弹性蛋白酶纯化和性质研究

用地衣芽孢杆菌发酵液制备弹性蛋白酶粗酶液,采用硫酸铵分级沉淀和Sephadex凝胶柱层析的方法分离纯化弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的酶学性质进行研究。结果表明：弹性蛋白酶粗酶液经40%～70%饱和度的硫酸铵纯化后比活力提高到120U/mg,经凝胶柱层析纯化后比活力可达到292U/mg,纯化倍数为12.6,SDS-PAGE法证实弹性蛋白酶分子质量为29.5kD。对酶学性质的研究结果表明：弹性蛋白酶最适反应温度为55℃,最适反应pH值为7.4,以刚果红-弹性蛋白为底物,米氏常数Km为9.67mg/mL。低浓度金属离子Ca2+和K+对酶活力有促进作用,而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+对酶活力则有抑制作用。     

一株深海来源苏云金芽孢杆菌SWJS07所产蛋白酶的分离纯化及性质研究

利用超滤、硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Sephadex G-75分子筛柱层析对一株南海深海来源菌苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)SWJS07所产蛋白酶进行分离纯化,纯化后经SDS-PAGE鉴定达到电泳纯,相对分子质量为37.0 k Da,酶的比活力提高了6.39倍,回收率为37.14%。研究其酶学性质表明,该蛋白酶最适催化温度为55℃,在30℃~45℃下稳定性较高,保温300 min残留酶活在80%以上;最适p H 6.5,在p H 6.0~9.0蛋白酶稳定,4℃放置24 h残留酶活在80%以上;2 m M Ca2+、Mn2+对蛋白酶有不同程度的激活作用,而Hg2+、Cd2+、Al3+则强烈地抑制蛋白酶活;当在蛋白酶中添加2 m M Ca2+、Mn2+时,其最适催化温度分别为60℃和55℃,蛋白酶活分别提高了32.86%和28.35%,60℃保温30 min相对酶活基本保持不变,与纯酶(相对酶活残留21.02%)相比蛋白酶的热稳定性显著提高;EDTA-Na2可强烈抑制蛋白酶活,推测该蛋白酶属于金属蛋白酶。     

低温贮藏中华管鞭虾肌肉品质及组织蛋白酶H活性变化

为探究不同贮藏条件下中华管鞭虾组织蛋白酶H活性及肌肉品质的变化情况,以中华管鞭虾为对象,分别在冷藏（4 ℃,0~6 d）和冻藏（?18 ℃,0~120 d）条件下,比较分析完整虾组和去头虾组肌肉pH、持水力、硬度、弹性、肌原纤维蛋白含量、水分含量及各亚细胞分级中组织蛋白酶H活性等指标的变化。结果表明,随着贮藏时间的延长,整虾和去头虾肌肉pH均不断升高,但去头虾组pH升高幅度略低于完整虾组;虾肉中肌原纤维蛋白含量随贮藏时间延长而逐渐降低,完整虾组和去头虾组在冷藏至6 d时分别降低了38.32%和30.88%,在冻藏至120 d时分别减低了61.67%和52.09%;在整个冻藏过程中,两组虾的硬度和弹性均出现先上升后下降的趋势,而冷藏贮藏过程中则始终呈现下降趋势;组织蛋白酶H在不同亚细胞分级中活性变化不同,冻藏条件下两组虾组织蛋白酶H酶活整体低于冷藏条件下酶活,且完整虾组组织蛋白酶H活性整体高于去头虾组。综上,在低温贮藏过程中,相比于完整虾形式,以去头虾的贮藏方式更有利于对虾肌肉品质的保障,且组织蛋白酶H活性受贮藏温度影响较大。研究结果为不同贮藏方式下中华管鞭虾理化特性及组织蛋白酶活性变化提供了理论基础。     

南极磷虾肉糜冷藏过程中蛋白水解酶的稳定性及自溶特性

以总蛋白酶活力为指标,研究3 种自制南极磷虾肉糜（虾肉糜）5 ℃冷藏过程中蛋白水解酶的稳定性,并以蛋白质组分、汁液流失率为指标,结合感官评价,研究其自溶特性。结果表明：在冷藏过程中,虾肉糜所含的消化腺蛋白酶稳定性较高,未充分漂洗的虾肉糜受到持续的水解;虾肉糜的自溶特性主要表现为盐溶性蛋白、碱溶性蛋白的降解和水溶性蛋白的增加,且汁液流失率增大和感官品质劣化。未漂洗虾肉糜的自溶现象尤为显著,不宜冷藏保存,而2 次漂洗虾肉糜在冷藏过程中自溶特性不显著,虽然存在一定的蛋白质组分变化和汁液流失率增加现象,但感官品质未大幅下降,因而适宜于短时间内在5 ℃进行冷藏保存。     

太平洋牡蛎冷藏过程中闭壳肌品质的变化

为了探究太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）在0℃和4℃冷藏过程中的品质变化,首先对牡蛎不同组织（闭壳肌、外套膜、鳃和内脏团）在冷藏过程中的表观变化进行观察,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析冷藏过程中各组织中全蛋白的变化,进一步通过Western blotting鉴定闭壳肌中肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）、肌动蛋白、副肌球蛋白（paramyosin,PM）和原肌球蛋白（tropomyosin,TM）的降解情况,采用荧光光谱分析闭壳肌冷藏过程中内源性丝氨酸蛋白酶和组织蛋白酶B的活力变化,以闭壳肌的pH、K值和质构特性等为评价指标,分析其在冷藏过程中品质的变化。结果显示,随着冷藏时间延长,闭壳肌由紧实变得绵软,表观变化最明显。Western blotting结果显示,在0℃和4℃冷藏过程中,闭壳肌中MHC分别在第3天和第1天开始降解,表明低温有利于降低蛋白酶解速率;但是,肌动蛋白、PM和TM无明显变化。...     

虾夷扇贝生殖腺凝胶状酶解物的流变特性

本文对虾夷扇贝生殖腺凝胶状酶解物的流变特性进行了研究,为虾夷扇贝的综合利用奠定研究基础。以虾夷扇贝雄性生殖腺为原料,选用木瓜蛋白酶作为工具酶,通过SDS-PAGE分析酶解过程中蛋白质分子量的变化,利用流变仪考察酶解液的流变特性;利用脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)在前期对样品进行孵育,探讨DNA分子对于其流变特性的作用影响。结果显示,虾夷扇贝雄性生殖腺经木瓜蛋白酶(30000 U/g蛋白)酶解15~180 min后,蛋白质发生显著降解。在不同流变仪扫描模式下,酶解液的储存模量G'、损耗模量G″、黏度η、复数黏度η*均明显高于未酶解样品。酶解3 h时,应变扫描中,应变为1%时,G'、G″分别达到了188.9 Pa和17.9 Pa;频率扫描中,频率为0.1 Hz时,η*达到230.9 Pa·s。经DNaseⅠ处理后,酶解液流变参数(G'、G″及η*)显著降低,但略高于未酶解样品。上述结果说明,虾夷扇贝生殖腺凝胶状酶解物以弹性占主导,具有明显的剪切稀化现象,且其流变特性可能与肽分子和DNA分子有关。     

喷雾干燥虾夷扇贝粉中3 种添加剂用量的预测模型

为防止虾夷扇贝粉喷雾干燥过程引起氨基酸等热敏性成分的损害,本实验采用3 种食品添加剂对氨基酸进行包埋。以虾夷扇贝匀浆后加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解,在水解液中加入不同配比的β- 环糊精、变性淀粉和CMC,研究添加剂配比对虾夷扇贝粉氨基酸保留率的影响。结果表明：当在虾夷扇贝水解液中加入25.61%β- 环糊精、25.52% 变性淀粉和2.96%CMC 时,控制喷雾干燥机进口温度125℃、出口温度80℃、进风量0.9m3/min 喷雾干燥得到的虾夷扇贝粉氨基酸保留率为56.43%,比对照氨基酸保留率提高了18.81%。通过Box-Benhnken 中心组合试验设计和响应面分析,得到氨基酸保留率Y 对β- 环糊精(X1)、变性淀粉(X2)、CMC(X3)的回归模型,该模型能预测氨基酸保留率,为虾夷扇贝粉的工业化生产提供参考。     

虾夷扇贝生殖腺酶解物-核糖美拉德反应产物抗氧化特性研究

本文选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶制备虾夷扇贝雌性生殖腺酶解物,再与核糖进行美拉德反应获得虾夷扇贝雌性生殖腺酶解物-核糖美拉德反应产物。采用DPPH自由基和亚油酸过氧化体系,评价美拉德产物的抗氧化能力。结果显示,碱性蛋白酶酶解效果较好,在酶解3 h时其水解度及TCA可溶性寡肽得率最高,分别达24.16%和20.79%。以DPPH自由基清除活性及亚油酸过氧化抑制活性为指标,确定了pH7条件下制备的虾夷扇贝雌性生殖腺酶解物-核糖美拉德产物抗氧化能力相对较强。通过比较半抑制浓度(IC50),美拉德产物的抗氧化能力较酶解物及核糖本身均显著提高(p0.05),但弱于抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。以上研究结果说明,虾夷扇贝生殖腺酶解物-核糖美拉德反应产物具有一定的抗氧化能力,具有潜在的开发价值。