枯草芽孢杆菌全细胞转化高效合成D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖是一种重要的稀少糖,在食品、化妆品和医药等领域都有着广泛的应用价值。目前,工业上生产D-阿洛酮糖以生物酶法为主。由于传统酶法存在步骤烦琐、成本高、产物纯化分离难等缺点,已难以满足工业生产需要。近年来,全细胞合成体系以其低成本、便操作、易分离等特点受到人们的关注。以一种来源于Caballeronia insecticola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)为研究对象,实现了在生产安全菌株枯草芽孢杆菌WB800中的高效异源表达,并以D-果糖为底物全细胞催化合成D-阿洛酮糖。为了提高DAEase的表达量,通过设计构建含有不同组成型启动子的重组菌株对其表达进行了优化。并对全细胞反应体系的条件(温度、pH值、金属离子、细胞浓度)进行了优化,探究了不同底物浓度下D-果糖的转化效率。结果表明：启动子P_ylbP介导下的重组DAEase在枯草芽孢杆菌WB800内具有较高的表达水平,重组DAEase全细胞反应的较适温度为65℃,较适pH值为9.5,较适金属离子为5 mmol/L Mg²⁺。采用全细胞方法以500 g/L D-果糖为底物制备D...     

重组大肠杆菌产卤代烷脱卤酶的发酵条件优化

对产卤代烷脱卤酶的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-DhaA进行发酵优化以提高其表达量。该研究从TB培养基出发,通过单因素实验与响应面实验在摇瓶水平上对培养基各成分进行优化;其次,在最优培养基的基础上对发酵的工艺条件进行优化;最后,在5 L发酵罐中进行了初步放大验证。结果表明,最优的培养基组成为：甘油10 g/L,酵母粉23 g/L,蛋白胨14 g/L,MgSO₄·7H₂O 1.3 g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L,酶活力可达到（1 182.94±10.86） U/L,较初始培养基提高了94%;最优的发酵工艺条件为：接种量5%,装液量40 mL/250 mL,37℃培养至OD₆₀₀为1.8时加入终浓度为0.4 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于20℃诱导22 h,酶活力可达到（3 585.83±15.02） U/L,提高至未进行优化前的5.87倍;5 L发酵罐初步放大验证实验中,酶活力最高达到（9 682.62±191.16） U/L,提高至摇...     

利用重组大肠杆菌和马克斯克鲁维酵母高效催化合成D-阿洛酮糖

提出了一种高效、低成本的两阶段生产D-阿洛酮糖的生产工艺。第一阶段,构建异源表达Flavonifractor plautii D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组大肠杆菌用于转化果糖,实现D-阿洛酮糖的全细胞生物合成。重组大肠杆菌在pH 7.5、65℃条件下反应最优,且在不添加金属离子、60℃反应条件下半衰期达到2.7 h,具有高热稳定性。在添加干重2.4 g/L重组大肠杆菌的D-果糖纯水溶液中,产物D-阿洛酮糖的终质量浓度为231 g/L,转化率达到33%。在添加硼酸根离子的条件下,D-阿洛酮糖的终质量浓度为378 g/L,转化率可以达到63%。在第二阶段,利用马克斯克鲁维酵母消耗混合体系中的D-果糖生产乙醇,降低分离成本。在不添加任何营养物质的情况下,在2种不同体系内,D-果糖均可以完全被消耗并产出约0.4 g/g的乙醇。该文研究结果为D-阿洛酮糖的低成本工业化生产奠定了良好的基础。     

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase, DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_hag介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P₄₃介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_hag的核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、 结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

海藻酸钠固定细胞产D-阿洛酮糖的研究

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用海藻酸钠作为载体,包埋重组大肠杆菌催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。以固定化细胞的酶活活力回收率为指标,优化出最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度3%,细胞包埋量60g/L,Ca Cl2浓度2%,固定化时间4h,0.01%浓度戊二醛溶液中交联4h。该条件下所得固定化细胞的酶活回收率高达76%,且具有较好的操作稳定性,重复操作8次后酶活回收率仍然保持61%。固定化后DPE细胞的最适酶反应温度提高了5℃、最适pH与游离细胞基本一致,耐热性明显提高,p H稳定性与游离细胞一致。     

苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量和活力,对高效表达圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM109进行培养,优化了发酵培养基成分、培养条件以及发酵工艺,结果表明,最佳葡萄糖浓度为20 g/L,碳氮比为7.86,添加5 g/L酵母粉和蛋白胨有利于菌体产酶,最佳发酵液初始pH为7.5,接种量为10 %.通过以上优化,重组大肠杆菌培养18 h时酶活可达到70 U/g(DCW),酶活比原工艺提高了1.6倍.     

重组甘油单酯脂肪酶GMGL的高效表达及固定化

该研究以来源于海洋地衣芽孢杆菌的甘油单酯脂肪酶GMGL为研究对象,在5 L发酵罐中优化了重组大肠杆菌的发酵条件,确定了最佳诱导培养条件：诱导温度25 ℃,发酵培养基pH 7.0,发酵液菌体OD600达到20时添加IPTG至终浓度为1 mmol/L,葡萄糖流加方式为变速流加。诱导培养24 h,菌体湿重达到125.40 g/L,发酵液活力为1985 U/mL,较优化前（1185 U/mL）提高了67.50%。进一步对GMGL进行固定化研究,确定最佳固定化条件为：酶载量为100 mg/g,磷酸盐缓冲液离子强度为0.50 mol/L,pH为9,优化后固定化GMGL的活力为4770 U/g,较优化前（1650 U/g）提高了189.09%。利用扫描电镜（SEM）和傅里叶红外光谱（FT-IR）对固定化酶进行表征,证实GMGL成功负载在ECR8285上。上述结果表明将为高活力甘油单酯脂肪酶的高效制备提供了一定的研究依据。     

库巴德巴利酵母FBKL2.0130 D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因的克隆表达及酶学性质研究

该研究从库巴德巴利酵母FBKL2.0130中克隆D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因ARD,利用闪电克隆技术构建重组质粒Yep-PAK,并将重组质粒导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A中,得到重组菌株W303-ARD并成功表达。并对重组菌株和亲本菌株的生长性能进行测定,并对重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶酶学性质进行研究。结果表明,与亲本菌株相比,重组菌株的D-阿拉伯糖醇脱氢酶的还原活力从（32.7±0.803） U/mL提高至（122.4±1.012） U/mL,氧化活力从（18.46±0.105） U/mL提高至（97.30±0.826）U/mL。重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶的最适反应温度为30 ℃,在25～40 ℃范围内氧化、还原活力均保持稳定。还原反应的最适pH值为9.0,在pH 9.0～11.0范围内比较稳定;氧化反应的最适pH值为7.0,在pH 7.0～8.0的范围内能保持较高的活性。Cu2+、Ba2+、Zn2+均能抑制重组酶活力;Mg2+对重组酶活力无明显影响;Ca2+、Mn2+、Fe3+均能提高重组酶活力。     

基于人工神经网络和遗传算法的普鲁兰酶重组大肠杆菌高密度发酵工艺优化

基于人工神经网络和遗传算法,对重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL 21表达热稳定普鲁兰酶的高密度发酵工艺进行优化。在5 L的发酵罐中,通过比较不同发酵温度、pH值及培养基碳氮比（C/N,mol/mol）对细胞量和产物产量的影响,确定最佳发酵工艺。结果表明,诱导前适合细胞生长的发酵条件为发酵温度34.4 ℃、pH 6.87、培养基C/N 6.1;诱导后适合产物表达的发酵条件为发酵温度32.5 ℃、pH 6.69、培养基C/N 5.3,最终获得细胞质量浓度56.5 g/L,重组蛋白产量3.21 g/L,酶活力为268.3 U/mL。     

响应面法优化重组大肠杆菌产ADI酶发酵培养基

在单因素优化的基础上,采用响应面分析方法对重组大肠杆菌生产精氨酸脱亚胺酶(ADI)的发酵培养基进行了优化。借助于SAS软件,结合Plackett-Burman和Box-Behnken实验设计对5种培养基组分进行优化。结果表明,最佳培养基组分为胰蛋白胨11.16 g/L,酵母提取物20 g/L,甘油6.3 g/L,磷酸氢二钾16.38 g/L,磷酸二氢钾2.31 g/L。采用优化后的培养基进行摇瓶发酵,ADI酶活达到5.7 U/m L发酵液,比初始培养基(3.72 U/m L发酵液)提高了1.53倍,比LB培养基(2.83 U/m L发酵液)提高了2.01倍。采用优化后的培养基在3 L发酵罐中进行发酵,ADI酶活达到15.17 U/m L发酵液,较LB培养基(4.32 U/m L发酵液)提高了3.51倍。     

Bacillus stearothermophilus麦芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis中的重组表达及发酵优化

为了实现Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶基因amyM(EC 3.2.1.133)在枯草芽孢杆菌中的重组表达,以opt-amyM/T质粒为模板进行PCR扩增得到目的基因,与表达载体pHY300PLK进行重组连接后转入宿主菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中进行表达。在TB培养基中发酵培养48 h,麦芽糖淀粉酶酶活达到250.7 U/mL。继续对重组菌氮源种类及复配、氮源质量浓度、碳源质量浓度等摇瓶发酵条件进行优化,确定其最佳产酶条件为:复合氮源为酵母浸膏25 g/L和大豆蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、培养基初始pH 6.5、最适培养温度41℃;在此条件下麦芽糖淀粉酶酶活可达396.7 U/mL,是优化前的1.6倍。在此基础上进一步对麦芽糖淀粉酶进行酶学性质进行测定:麦芽糖淀粉酶最适温度为60℃,最适pH为5.5,半衰期为325 h,Km为0.95 g/L,比活为2646 U/mg。     

毕赤酵母产伏马毒素B1羧酸酯酶发酵条件和培养基的优化

为提高毕赤酵母重组菌产伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)羧酸酯酶的摇瓶发酵水平,以酶活力为指标,对发酵条件和培养基进行优化。通过单因素试验对发酵条件进行优化。通过Plackett-Burman试验筛选出关键培养基成分,再进行正交试验建立试验数据样本,最后建立误差反向传播神经网络模型进行预测并寻找最优发酵培养基组成。经优化得到的发酵条件:诱导温度28℃,初始p H 6.0,每24 h补加体积分数为1%的甲醇,诱导96 h;优化后发酵培养基组成:蛋白胨23 g/L、KH2PO444 g/L、PTM4 (Pichia trace minerals 4)微量元素溶液1.5 m L/L、K2SO47.15 g/L、Mg SO4·7H2O 5.85 g/L和酵母粉5 g/L。FB1羧酸酯酶酶活力达到402 U/m L以上,较优化前提高了1.19倍。优化后显著提高了重组菌株的产酶能力,研究结果为FB1羧酸酯酶发酵罐优化提供了基础数据。     

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ的高效融合表达及其酶学性质研究

目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ（chondroitinase ABC Ⅱ,ChSase ABC Ⅱ）的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABC Ⅱ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABC Ⅱ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABC Ⅱ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氨酸标签（polyhistidine-tag,His-tag）的ChSase ABC Ⅱ融合蛋白后,研究了His-ChSase ABC Ⅱ的部分酶学性质。结果:构建的His-ChSase ABC Ⅱ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coli BL21(DE3)和诱导剂（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）浓度为125 μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABC Ⅱ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40 ℃,其在30~40 ℃条件下较为稳定,且半衰期在2 h以上。His-ChSase ABC Ⅱ能特异性有效分解硫酸软骨素,其K_m值为10.4±0.8 μmol/L,K_cat值为9.4±0.2 s?1。结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABC Ⅱ的高效表达和纯化。此外,His-ChSase ABC Ⅱ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求。     

干酪乳杆菌发酵芡实上清液的活性成分及抗氧化活性分析

以芡实为原料,研究干酪乳杆菌发酵过程中上清液中活性成分及抗氧化活性的变化。通过干酪乳杆菌发酵芡实,对其发酵过程中上清液的pH、可滴定酸、多肽产率、多肽分子量分布、游离氨基酸组成、总酚、总黄酮及抗氧化活性的变化进行了研究,并分析各组分与抗氧化活性的相关性。结果表明,在发酵过程中pH呈降低趋势,而可滴定酸含量逐渐升高,在发酵48 h后分别达到3.97±0.02和2.53±0.04 mL/g;多肽产率呈上升趋势,在发酵结束时达到19.09%±0.42%,其中500～180和<180 Da的低分子量多肽比例显著增加（P<0.05）;游离氨基酸总量在发酵过程中增加了5.62倍;总酚和总黄酮的含量持续显著增加（P<0.05）,在发酵结束时分别达到18.00±0.20和10.99±0.14 μg/g;发酵芡实上清液的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和亚铁离子螯合能力在发酵结束时均显著提高（P<0.05）,可滴定酸、多肽产率、总游离氨基酸含量、总黄酮和总酚含量与抗氧化活性具有极显著（P<0.01）正相关关系。综上,干酪乳杆菌发酵可以促进芡实抗氧化活性物质的释放,提高其发酵上清液的抗氧化活性,可以为芡实产品的开发提供参考。     

三株产几丁质酶菌株的筛选、产酶条件优化及水解虾壳的研究

目的:筛选鉴定产几丁质酶的菌株并优化其发酵条件,最终应用于虾壳降解研究。方法:以盐城市滩涂海泥为样品,利用平板筛选水解几丁质的菌株,运用生物信息学方法鉴定菌株,通过单因素优化其发酵条件,并将筛选得到的菌株和优化后的发酵条件用于虾壳发酵。结果:鉴定得到三株显著降解胶体几丁质的菌,分别是发光杆菌（Photobacterium sp. LYM-1）、需钠弧菌（Vibrio sp. WM-1）和希瓦氏菌（Shewanella sp. ZXY-1）;优化发酵条件:发光杆菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为32 ℃,发酵1 d酶活最高为15.37±0.55 U/mL,是优化前的4.37倍;需钠弧菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为7.5,温度为22 ℃,发酵2 d酶活最高为40.82±6.03 U/mL,是优化前的1.60倍;希瓦氏菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为(NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为22 ℃,发酵1 d酶活最高为25.64±3.29 U/mL,是优化前的2.47倍;三株菌均能利用虾壳产几丁质酶,但利用效率均低于几丁质,酶活力分别为10.25±0.95、32.16±2.25和21.81±4.27 U/mL。结论:本研究从盐碱地筛选得到三株产几丁质酶的菌株,优化后酶活力均得到提高,且均能利用虾壳产几丁质酶,为发酵虾壳制备几丁质酶提供新的菌株来源。     

D-阿洛酮糖合成及偶联酿酒酵母发酵的研究

该研究利用含有组成型启动子的质粒pET-20b载体,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中对3种D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行异源表达,其后以D-果糖为底物进行静息细胞转化。结果表明,重组菌在摇床30 ℃、200 r/min转速下发酵48 h,能够利用D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖,转化率分别达到27.56%、23.99%和25.98%。为降低D-果糖对D-阿洛酮糖纯化过程中的影响,在产糖的过程后偶联酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）好氧发酵过程,消耗掉混合糖液中的D-果糖,结果显示转化24 h后D-果糖去除率达到94.22%,该研究为下游D-阿洛酮糖的分离和纯化提供了新的思路。