不同来源植物乳杆菌基因组的比较分析

目的 对分离自母乳、婴儿肠道的植物乳杆菌进行全基因组测序,分析菌株间亲缘关系和细菌素合成相关基因。方法 本研究采用Illumina高通量测序平台对不同来源的植物乳杆菌进行全基因组测序,质控过滤后的数据经Unicycler组装获得基因组精细图,通过比对COG、CAZy数据库对功能基因进注释,并借助BAGEL4等生物信息学分析工具鉴别植物乳杆菌素合成相关的基因簇,分析不同来源植物乳杆菌的益生潜力。结果 本研究5株植物乳杆菌基因组平均GC含量为44 %,母乳源植物乳杆菌基因数量多于婴儿肠道源菌株。进化树和ANI分析结果显示,分离所得菌株具有较高的同源性,相同来源的菌株更倾向于聚类到一个分支。功能注释结果显示,母乳源菌株与肠道源菌株相比拥有更多编码碳水化合物代谢的基因,且拥有完整的产植物乳杆菌素基因簇。结论 植物乳杆菌基因组GC含量、功能基因数目及产细菌素基因簇结构等与分离源有一定的关联,母乳源植物乳杆菌更适于作为潜在益生菌的候选菌株,本研究为益生菌的益生潜力研究提供了遗传学基础。     

植物乳杆菌C8-1产类细菌素的初步研究

从发酵2周的泡菜中分离到66株乳杆菌,以其中4株乳杆菌作为出发菌株进行紫外诱变处理得到一株产类细菌素的突变株C8-1。基于细胞形态、生理生化和16S rDNA测序数据,菌株C8-1被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。菌株C8-1所产的类细菌素具有较宽的抑菌谱,能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多种食品腐败菌和致病菌;有较好的热稳定性,在4℃冷藏5 d和-20℃冷冻5d以及60,80,100℃和121℃分别加热15 min,活性损失均不超过6%;且抑菌活性随pH值增大逐步降低,当pH≥6时,抑菌活性消失,对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶耐受性较强,对胰蛋白酶较为敏感。这些数据表明,产类细菌素的植物乳杆菌C8-1在食品加工中具有进一步地潜在应用价值。     

源自泡菜的植物乳杆菌产新型广谱抑菌细菌素的特性分析

筛选对食源性致病菌和腐败菌有特异性抑制作用的产细菌素乳酸菌菌株,并研究细菌素的特性,为其在食品防腐中的应用提供参考。从分离自泡菜的112 株乳酸菌中反复筛选得到1 株产细菌素（BacH32）菌株（Hlh32）,经鉴定菌株Hlh32为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,其在35 ℃ MRS培养基中发酵至稳定期即18～24 h达到最大BacH32产量（对金黄色葡萄球菌的抑菌活性达到1 850 AU/mL）。通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-15凝胶过滤层析、制备型高效液相色谱等方法进行纯化。Trinice十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示BacH32分子质量为6.7 kDa,与文献报道的植物乳杆菌细菌素分子质量有显著差异。细菌素BacH32对蛋白酶敏感,而脂肪酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶对其无影响,表明BacH32为蛋白质。BacH32在pH 2～9的环境下孵育4 h,在37、60、80、100 ℃保持30 min或121 ℃保持15 min仍能保持较好抑菌活性。细菌素BacH32对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌活性,对真菌也有一定的抑菌活性。向培养至对数初期的金黄色葡萄球菌中添加BacH32,菌体生长完全受到抑制。以上特性表明植物乳杆菌Hlh32合成的细菌素BacH32有潜力作为天然食品防腐剂在食品中使用。     

产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

利用溶钙圈法及牛津杯双层平板法,从欧洲萨拉米香肠、新疆奶酪、自发酵泡菜和韩式辣白菜中分离筛选产细菌素的乳酸菌,通过形态学、生理生化鉴定、16S rDNA将菌株鉴定到种,并对其细菌素基因进行克隆,确定细菌素种类。结果表明:从分离纯化到的206株乳酸菌中筛选出抑菌效果较好的菌株SA102、SA104、N105、N107、N108,在排除酸、过氧化氢等干扰因素后,菌株所产抑菌物质对蛋白酶敏感,初步判定起抑菌作用的是细菌素。16S r DNA结果表明这5株产细菌素的菌株2株为乳酸乳杆菌,3株为植物乳杆菌,通过设计引物对菌株细菌素基因进行PCR快速筛选,结果表明菌株N107、N108含有IIb类细菌素Plantaricin KJ基因编码序列,生理生化指标测试证实这些产细菌素菌株不产气、不产氨、不产硫化氢、不产粘、不产色素,具有较好的生物安全性。最后对发酵液中细菌素粗提物的酸碱稳定性和温度稳定性进行了初步探究,以期为将来细菌素的进一步实际应用提供一定的理论借鉴。     

1 株水开菲尔粒中植物乳杆菌的鉴定及产细菌素基因分析

目的：对从水开菲尔粒中分离得到1 株能产生抑菌物质的菌株QF01进行菌种鉴定,并对其产细菌素进行实验、鉴定和基因序列分析。方法：通过牛津杯法测定抑菌能力,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增16S rDNA和细菌素相关基因并测序,利用ProParam tool、TMHMM 2.0、InterProScan、SOPM和SWISS-MODEL在线软件对基因编码产物进行分析。结果：该菌株产的细菌素对大肠杆菌（Escherichia coli JM109）有明显的抑制作用,通过16S rDNA序列分析初步确定该菌株属于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。该菌株含有plnD、plnEF、plnV、plnR四种基因,其中plnV基因编码产物有跨膜螺旋结构,其结构存在信号肽特征。此外,从三级结构的模型预测得到4?种基因的编码产物均存在α-螺旋、β-转角、伸展链和无规则卷曲。结论：从水开菲尔粒分离得到的L. plantarum QF01菌株,含有plnD、plnEF、plnV、plnR细菌素基因,对大肠杆菌有很好的抑制作用。     

酸菜中具有抑菌活性乳酸菌的分离鉴定及其产细菌素特性

目前已有研究陆续从不同的乳酸菌中分离到细菌素,但是这些细菌素存在着抑菌谱窄的问题,寻找广谱抗菌性能的新一代细菌素具有重要的理论价值和应用前景。以市售保质期较长的8种不同品牌的酸菜为材料,将青霉菌作为指示菌,通过抑菌实验筛选出一株能产生抑菌物质的菌株L3,经过生理生化鉴定、16S rDNA测序分析确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),故命名为植物乳杆菌L₃,NCBI序列号为MT781360。该菌株在MRS培养基中于37℃培养18~24h时产细菌素L3的抑菌活性最强。将该培养上清液采用乙酸乙酯萃取,葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50过滤分离纯化,再经Trinice-SDS-PAGE电泳结果显示,细菌素L3的分子质量约为4~5kDa。细菌素L3对蛋白酶敏感,但其活性不受过氧化氢酶的影响,初步结果显示细菌素L3为蛋白质类物质。细菌素L3在60~100℃ 处理20min或121℃处理15min仍具有较高的抑菌活性,pH值2~10范围内有良好的稳定性;对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及部分真菌具有抑菌活性。植物乳杆菌L₃分泌的细菌素L3除了具备现有细菌素的稳定性和对革兰氏阳性细菌的杀菌能力以外,还能对革兰氏阴性细菌和真菌起到抑菌效果,这对于易被真菌污染导致腐败的果蔬类产品及乳制品的保藏具有重要意义,希望研究可为具有广谱抗菌性能的天然防腐剂的生产提供新的菌种。     

一株产细菌素乳杆菌的鉴定及其细菌素编码基因的获得

应用双层平板打孔法,从自制樱桃酒里分离的乳杆菌中筛选到一株对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有明显抑制作用的菌株,命名为LD 1.0008。通过API 50 CHL糖发酵产酸实验、16S rDNA基因序列分析及其特异性recA基因多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,鉴定LD 1.0008为植物乳杆菌。排除有机酸的干扰,用多种蛋白酶处理后,其抑菌活性均有明显降低,而用过氧化氢酶处理后其抑菌活性基本不变,从而确定LD 1.0008所产生的抑菌物质为细菌素。使用已报道的10 对植物乳杆菌细菌素基因片段设计的引物对菌株LD 1.0008进行PCR扩增,发现其至少含有4 个植物乳杆菌素相关编码基因,即plnD、plnO、plnV和plnW。     

与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

广谱抑菌乳酸菌的筛选及其细菌素相关基因分析

采用琼脂扩散法,从分离自新疆传统酸奶的8株乳酸菌中筛选出1株抑菌效果较好并具有广谱抑菌性的菌株B6,通过革兰氏染色、生理生化及16S rDNA序列比对,鉴定该菌为植物乳杆菌。植物乳杆菌B6发酵液经排除酸、过氧化氢实验后,仍有抑菌效果,且对蛋白酶敏感,判定该菌产细菌素。通过设计10对编码合成细菌素相关基因的特异性引物,以菌株B6的DNA为模板,进行聚合酶链式反应快速鉴定。结果表明,菌株B6含有编码IIb类细菌素结构基因plnE/F/J/K,plnJ与植物乳杆菌C11相比,序列仅在前导肽区出现一处氨基酸突变,相似度为99%,plnE/F/K序列与植物乳杆菌C11的这3个基因序列完全相同。因此鉴定植物乳杆菌B6产生的是IIb类细菌素。     

植物乳杆菌WUH3细菌素合成基因分析及其特性研究

植物乳杆菌WUH3(Lactobacillus plantarum WUH3)是从中国传统腌制黄瓜中分离得到的1株具有良好抑菌活性的乳酸菌。该文通过对L.plantarum WUH3进行基因分析和试验验证来探明其性质和应用价值。首先,该文对L.plantarum WUH3进行了全基因组测序,从基因层面分析其潜在特性,结果显示,该菌株含有与细菌素合成相关的多种转运蛋白基因,以及3种细菌素：Plantaricin＿EF、Pediocin和Enterocin＿X＿chain＿beta,表明该菌株具有细菌素的合成分泌能力。一系列验证试验结果表明,该菌株可分泌蛋白质类细菌素,其分子质量为4.1～6.5 kDa,具有良好的热稳定性(121℃,30 min)和pH稳定性(pH 2～11)。进一步研究结果表明,该细菌素对多种腐败菌和致病菌有抑制作用,具备广谱抑菌性;其通过作用于细菌的细胞膜表面,致使其细胞膜破裂,从而发挥抑菌性能。最后,该文对L.plantarum WUH3进行安全性分析,发现其为非人类致病菌,可被应用于食品防腐领域。该研究为L.plantarum WUH3的开发和应用提供了一定的参考...     

浓香型窖泥中高产细菌素乳酸菌的鉴定及特性

以双层琼脂扩散法从浓香型窖泥中筛选出1株(LP16)具有高抑菌活性的菌株,研究其代谢产物在窖泥中的作用。结果表明:经形态观察、生理生化试验和16S rRNA鉴定出菌株LP16为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei);其发酵上清液在排除有机酸、过氧化氢干扰后仍有明显抑菌效果,而经胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶处理后残余抑菌率分别为40.43%、43.48%、47.83%和51.30%,抑菌活性部分丧失,说明抑菌成分包含蛋白属性的细菌素;菌株LP16所产细菌素分别经高温、低pH(pH<5)、紫外线照射、表面活性剂处理均能保持抑菌活性,且在pH2~10范围内具有pH耐受性;抑菌谱较广,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及部分乳酸菌有明显的抑制作用,但对霉菌和酵母菌无抑制作用。因此在浓香型白酒生产中该菌产生的细菌素不仅能抑制病原菌的生长,也能控制乳酸的过多生成。     

大菱鲆肠道中广谱拮抗活性乳酸菌的筛选及其细菌素鉴定

应用牛津杯法从大菱鲆肠道分离的乳酸菌中筛选出对革兰氏阳性和阴性细菌均具有抑制作用的菌株LP1-4,经生理生化反应和16S rRNA鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。通过温度、pH值和蛋白酶等因素分析,结果表明菌株LP1-4无细胞上清液（cell-free supernatant,CFS）中抑菌物质具有良好的热稳定性,在pH 2.5～5.0具有抑菌活性,且对蛋白酶敏感,初步判断为细菌素类抑菌物质。菌株LP1-4在最佳培养时间24 h时抑菌活性达到峰值,应用乙酸乙酯萃取后抑菌圈直径达25.42 mm。采用Labscale TFF System超滤分离和Sephadex G-25凝胶层析获得小于1.0 ku分子质量的细菌素。经高效液相色谱纯化分析,抑菌物质在液相分离条件下目标峰的保留时间为5.0 min。采用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱确定细菌素分子质量为0.854 ku,其氨基酸排列顺序为谷氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸（ENKPAAPK）。本研究从大菱鲆肠道筛选具有广谱抗菌活性的菌株LP1-4,对研发控制水产品腐败菌和致病菌的乳酸菌生物防腐保鲜制剂具有潜在的应用价值。     

Comparative study of the pln locus of the quorum-sensing regulated bacteriocin-producing L. plantarum J51 strain

Lactobacillus plantarum J51 strain was isolated from a Rioja red wine and it showed bacteriocin activity against a wide range of lactic acid bacteria of oenological importance. These characteristics conferred L. plantarum J51 a high interest both in wine microbiology and in the study of bacteriocin production. In this work the bacteriocin production regulated under the "quorum-sensing" mechanism is observed and the pln locus of the bacteriocin-producing L. plantarum J51 is fully characterized. A 20,667 bp fragment was completely sequenced (GenBank accession number DQ340868), and showed five operons (plNC8betaalphac, plnLR-like, plnABCD, plnEFI, plnGHSTUVW) and a new region containing a putative operon with three new orfs that could encode a putative two-peptide bacteriocin.     

产抑菌物质乳酸菌的筛选及其抑菌特性研究

目的 本文旨在筛选具有广谱抑菌活性的乳酸菌,为其在食品保鲜中的应用奠定基础。方法 以MRS和M17为培养基,对韩国传统泡菜中乳酸菌进行分离鉴定,通过琼脂孔扩散法筛选具有广谱抑菌活性的乳酸菌,并分析它的耐酸、耐胆盐能力,以及对温度、pH、发酵时间的敏感性。结果 以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌为指示菌进行抑菌活性筛选,获得一株抑菌效果最佳的植物乳杆菌PC4-5。植物乳杆菌PC4-5在酸性条件（pH=2）处理2 h后存活率达到43.79%,0.5%胆盐处理2 h后存活率达到21.02%,说明植物乳杆菌PC4-5具有较好的耐酸、耐胆盐能力。经排酸排过氧化氢试验后,发酵上清依然保留抑菌活性,蛋白酶处理后抑菌活性丧失,表明该抑菌物质为细菌素。该细菌素在pH为2-6的范围有抑菌能力,且有较好热稳定性。结论 植物乳杆菌PC4-5适用于酸性食品的防腐保存,在食品保鲜中的应用有较大的潜力。     

植物乳杆菌素研究进展

植物乳杆菌素是植物乳杆菌产生的一类具有抑菌活性的肽类，可以抑制许多革兰氏阳性菌。作者简述了细菌素的分类、植物乳杆菌素的抑菌范围和抑菌机制，并简要介绍了几种植物乳杆菌素的性质。尽管目前植物乳杆菌素还未被批准作为防腐剂在食品中使用，但植物乳杆菌已被广泛地应用到食品工业中，相信不久的将来植物乳杆菌素作为一类理想的天然食品防腐剂，应用前景将十分广阔。     

BACTERIOCIN EXPOSURE AND FOOD INGREDIENTS INFLUENCE ON GROWTH AND VIRULENCE OF LISTERIA MONOCYTOGENES IN A MODEL MEAT GRAVY SYSTEM

The antilisterial activity of bacteriocin-producing Lactobacillus sakei 1 bac⁺ alone and combined with food ingredients (sodium chloride, D-glucose, oregano, black pepper) was studied in a model meat gravy (1.8% proteose peptone, 1.2% meat extract, 0.6% yeast extract, 2.0% corn starch) kept under refrigeration for 10 days. Two strains of L. monocytogenes (serotypes 4b and 1/2a) were employed in coinoculation experiments and Lactobacillus sakei ATCC 15521 was used as a negative control for bacteriocin production. The LAB bac⁺ strain was more effective in inhibiting both L. monocytogenes serotypes than the LAB bac⁻ strain. The serotype 4b was more sensitive to bacteriocin than serotype 1/2a. The effect of the ingredients on inhibition of L. monocytogenes was serotype dependent. Bacteriocin exposure did not affect sensitivity to ampicilin and rifampicin. However, L. monocytogenes partially lost their hemolytic activity after exposure to bacteriocin-producing Lb. sakei 1 and food ingredients.     

枯草芽孢杆菌拮抗菌的筛选鉴定及其抑菌特性研究

本研究旨在从泡菜中筛选一株对枯草芽孢杆菌具有拮抗作用的产抗菌肽乳酸菌,并对抗菌肽的性质及抑菌效果进行初步研究。以Bacillus subtilis B39为指示菌,通过溶钙圈法初筛、双层琼脂扩散法复筛得到一株具有较强抑制效果的乳酸菌,对其进行形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA基因的系统发育分析。利用硫酸铵沉淀法和有机溶剂萃取法探究抗菌肽的最佳提纯方法,并对该抗菌肽进行紫外全波长扫描定性和一系列抑菌特性的研究。结果表明,从武汉钢花菜市场泡菜样品中筛选到一株对B. subtilis B39具有较强抑制作用的产抗菌肽乳酸菌,通过16S rDNA序列（GenBank 登陆号:MZ751041.1）结合系统发育树分析,鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）并将其命名为L. plantarum WUH3。通过对比发现,采用有机溶剂-乙酸乙酯萃取法可获得抗菌肽的最佳提纯效果,紫外全波长扫描结果显示,该纯化物质具有显著的肽类特征吸收峰。根据L. plantarum WUH3的生长曲线及抑菌活性曲线可知,该菌在生长稳定期时可达最大抗菌肽产量。二倍稀释法测得抗菌肽对B39的MIC为16 μg/mL。通过时间杀菌曲线可知,该抗菌肽对Bacillus subtilis B39具有杀菌作用。该研究在探索可抑制枯草芽胞杆菌的生物拮抗菌方面具有一定的借鉴意义,为L. plantarum WUH3在天然防腐剂领域的开发和应用奠定了基础。     

1 株牦牛源产细菌素植物乳杆菌的益生特性分析

为研究1 株从牦牛体内分离筛选出的高产细菌素的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SWUN5815的益生特性,本研究通过测定其抗菌活性、耐酸耐胆盐能力、黏附能力及对小鼠体质量和肠黏膜免疫影响评价其益生能力。结果表明：该菌株对牦牛源食源性致病微生物具有很强的广谱抑菌活性;在pH?2和pH?3时存活率分别为58.2%和86.9%,胆盐质量分数0.3%时存活率为66.8%,具有良好的耐酸耐胆盐能力;对Caco-2细胞黏附率为42%;对常用的抗生素敏感,不具有耐药性。短期喂服植物乳杆菌SWUN5815可以显著提高小鼠体质量（P＜0.01）,同时还可提升小鼠肠道SIgA的表达水平（P＜0.01）。综上所述,本研究分离得到的植物乳杆菌SWUN5815能很好地适应胃肠环境压力,有效提高小鼠的体质量和免疫功能,可作为候选益生性菌株。     

Potential of lactic acid bacteria isolated from specific natural niches in food production and preservation

Autochthonous strains of lactic acid bacteria (LAB) have been isolated from traditionally homemade cheeses collected from specific ecological localities across Serbia and Montenegro. Genetic and biochemical analysis of this LAB revealed that they produce bacteriocins, proteinases and exopolysaccharides. LAB produces a variety of antimicrobial substances with potential importance for food fermentation and preservation. Apart from the metabolic end products, some strains also secrete antimicrobial substances known as bacteriocins. Among the natural isolates of LAB from homemade cheeses, bacteriocin producers were found in both lactococci and lactobacilli. Lactococcus lactis subsp. lactis BGMN1-5 was found to produce three narrow spectrum class II heat-stable bacteriocins. In addition to bacteriocin production, BGMN1-5 synthesized a cell envelope-associated proteinase (CEP) and shows an aggregation phenotype. Another isolate, L. lactis subsp. lactis BGSM1-19 produces low molecular mass (7 kDa) bacteriocin SM19 that showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Micrococcus flavus and partially against Salmonella paratyphi. Production of bacteriocin reaches a plateau after 8 h of BGSM1-19 growth. Bacteriocin SM19 retained activity within the wide pH range from 1 to 12 and after the treatment at 100 degrees C for 15 min. Among collection of lactobacilli, the isolate Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8 produces heat-stable bacteriocin SJ (approx. 5 kDa) polypeptide. It retained activity after treatment for 1 h at 100 degrees C, and in the pH range from 2 to 11. In addition to isolates from cheeses, bacteriocin-producing human oral lactobacilli were detected. Most of them showed antimicrobial activity against streptococci, staphylococci and micrococci, but not against Candida. Isolate BGHO1 that showed the highest antimicrobial activity was determined as L. paracasei. Interestingly, Lactobacillus helveticus BGRA43, which was isolated from the human intestine showed strong activity against Clostridium sporogenes, but it was not possible to detect any bacteriocin production in this isolate by using standard procedures. Further analysis of antimicrobial activity revealed that BGRA43 has a relatively broad spectrum. Lactobacilli resistant to nisin were also detected among natural isolates. They produce bacteriocins, which have no activity against nisin producing lactococci.