磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

对磷脂酶D(phospholipase D,PLD)进行重组表达,并探究其在生物催化合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)中的应用。以大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)作为PLD的异源表达宿主,构建重组菌E. coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子量,并对培养条件进行优化,进一步探究重组菌的酶学性质。在有机相-水相双相反应体系中进行PS的制备,并对制备工艺进行系统优化。成功构建了重组菌株E. coli BL21 (DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子质量约为60 k Da。重组菌通过诱导条件优化,酶活最高可达38. 58 U/m L,是优化前的2. 26倍。PLD粗酶液的最适p H值为7. 5,最适反应温度为60℃。制备工艺优化结果表明40℃条件下,在8 m L的乙酸乙酯中溶解64 mg的卵磷脂,在4 m L酶液中溶解160 mg的L-丝氨酸,得到的PS转化率最高,可达28%,产量为1. 34 g/L。该PLD粗酶液催化性能良好,为酶法制备磷脂酰丝氨酸奠定了基础。     

Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析

以Streptomyces septatus TCCC 21057基因组为模板,扩增得到磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因(pld),经合成获得pld密码子优化基因(pldm),以pPIC9K为表达载体,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为宿主菌株,构建获得毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-pldm,摇瓶发酵后获得的重组PLD(rPLDM)转酯活力达2.37 U/mL;rPLDM经纯化后进行转酯酶学性质分析,其最适作用温度为60℃,最适作用pH值为6.5;在单水相反应体系中,40℃、pH 6.5、Ca~(2+)浓度10 mmol/L、大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸物质的量比1∶10、rPLDM添加4.0 U/mL,反应6 h后,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的产率可达到33%。本研究通过对rPLDM的重组表达、转酯酶学性质及催化合成PS的研究,为进一步实现酶法合成新资源食品PS奠定了基础。     

磷脂酶D单一水相法催化合成磷脂酰丝氨酸工艺研究

研究了磷脂酶D单一水相法催化合成磷脂酰丝氨酸(PS)的工艺,单因素实验结果表明,用水量以及粗大豆磷脂(磷脂酰胆碱:25%)的比例、L-丝氨酸用量、反应温度以及反应时间都对磷脂酰丝氨酸的制备有一定的影响。通过正交实验优化利用单一水相法通过磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的最佳工艺参数如下:用水量-粗大豆磷脂的比例为2:1、丝氨酸浓度为0.6g/m L、反应温度为50℃以及反应时间为30h。在此工艺条件下在该工艺条件下主要通过减少水的用量以及增加丝氨酸的用量能够有效克服单一水相法的缺点,抑制磷脂酶D的水解活性,最终使反应体系中磷脂酰丝氨酸的含量为15.78%,PS的转化率约为63.12%。该工艺相比有机溶剂-水双相反应更具优势,在此基础上,该工艺有望通过进一步的研究以提高反应过程中PS的转化率。     

磷脂酶D的纯化及催化制备磷脂酰丝氨酸研究

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶层析对广岛链霉菌SK43.001-11发酵液中的磷脂酶D进行纯化,并对双液相体系中酶法制备磷脂酰丝氨酸的工艺进行研究。结果表明,纯化后,磷脂酶D比酶活提高到49.48 U/mg,是粗酶液的54. 37倍,回收率为32.31%。磷脂酶D双液相催化制备磷脂酰丝氨酸的最佳条件为:有机相为乙醚,pH6.5,反应温度30℃,L-丝氨酸与磷脂酰胆碱质量比15∶1,有机相与水相体积比1∶1,反应时间2.5h。在最佳条件下,磷脂酰丝氨酸生成率达到74.8%。     

磷脂酰-N-乙酰氨基葡萄糖苷的合成及脂质体制备

为了提升磷脂酰-N-乙酰氨基葡萄糖苷（PtdGlcNAc）的合成效率,选取不同的咪唑类离子液体,通过以磷脂酶D（phospholipase D,PLD）催化磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）与N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-beta-D-glucosamine,GlcNAc）的转酯反应,探究离子液体预处理对酶催化性能的影响。结果表明,经过1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[BMIm][PF6]）预处理后,PLD的活性明显高于其他离子液体组和空白组。因此,采用[BMIm][PF6]作为PLD预处理的孵育溶液,通过优化实验,得到最佳反应条件为：1 U的加酶量,底物PC与GlcNAc的物质的量比为1∶60,环戊基甲醚作为有机相,离子液体与水体积比为4∶1,反应时间12 h,产率为79.7%,与未处理组的产率相比提升了56.9%。将合成的PtdGlcNAc制备成纳米脂质体,并对其结构进行了初步表征。该研究丰富了PLD反应体系的相关研究,为其他新型磷脂酰化合物的合成和应用提供了参考。     

固定化磷脂酰胆碱水相酶催化合成磷脂酰丝氨酸

本文构建了一种固定化底物磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)水相催化体系,磷脂酶D转化PC合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)新技术。探讨了沉淀剂种类、载体类型和底物初始添加量等主要因素,对固定化底物PC过程中PC吸附率的影响,获得了最佳工艺参数。在此基础上,进一步研究了固定化底物PC酶法合成PS的时间反应动力学和酶重复利用特性。结果表明,催化反应24 h后,PS得率为98.74%,磷脂酶D重复使用10次,PS得率仍然大于60%。文章还比较了固定化底物水相催化体系和双液相催化体系酶法合成PS效果,结果发现,固定化底物水相催化体系中PS得率和酶循环利用特性均优于双液相催化体系。本文研究结果为今后酶法改性PC合成PS提供了一种新的催化反应体系。     

微生物磷脂酶D的克隆表达研究进展

磷脂酶D（Phospholipase D, PLD, EC 3.1.4.4）是催化磷脂的磷酸二酯键水解和转磷脂酰基反应的一类酶的总称。PLD所具有的转磷脂活性使其在食品、医药以及细胞生物学等领域具有广泛的应用价值,但其大规模工业化生产受到诸多因素的限制。利用基因工程技术对磷脂酶D基因进行克隆表达,开发高产量、高纯度和高转磷脂活性的PLD资源成为当前的研究热点。本文主要对微生物PLD克隆与高效表达方面的研究进展进行分析,以期对微生物PLD的大规模生产及其相关产品的开发利用提供参考。     

磷脂酰丝氨酸的酶法制备与分离研究进展

磷脂酰丝氨酸(PS)的制备有溶剂提取法、化学合成法和酶转化法。采用溶剂提取法从动物组织提取PS由于"疯牛病"原因而受质疑;化学合成法成本较高,工艺复杂,且纯度和收率有待提高;酶转化法具有反应条件温和、反应易控、高效简单的优势,越来越受到关注。主要对磷脂酰丝氨酸的酶法制备以及分离纯化方法进行了综述,对其生产制备过程提出了合理的建议和策略。     

酶法合成富含二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸

通过以鱿鱼卵磷脂和L-丝氨酸为原料,对磷脂酶D催化酰基转移反应制备磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的工艺条件进行探索,并进行了优化试验,确定反应的最佳工艺。通过单因素试验法分别探讨有机相种类、反应温度、水相p H、有机相水相体积比、底物质量比、酶量、反应时间等因素对PS合成率的影响,得到初步优化条件。之后,做四因素三水平的正交试验,优化制备PS的工艺条件。最优工艺条件:水相p H4.5、有机相水相体积比5∶6、反应温度40℃、酶量40 U、底物质量比1∶32、反应时间6 h。在该条件下PS合成率为97.65%,DHA含量为33.10%。     

磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺研究

本文研究了磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的工艺,实验结果表明有机相和水相比例、磷脂酰胆碱(PC)浓度、反应温度、水相pH以及反应时间都对磷脂酰丝氨酸的制备有一定的影响。通过正交实验优化利用磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸的最佳工艺为:有机相和水相的比例为4/4、PC浓度为75mg/mL、反应温度为40℃、水相pH值为4.0、反应时间为12h,在此工艺条件下磷脂酰丝氨酸得率为:68.9%。     

化学与生物法制备抗坏血酸棕榈酸酯及其食品应用研究进展

L-抗坏血酸棕榈酸酯(L-AP),是一种重要的抗坏血酸衍生物,是一种高效,营养,绿色的食品添加剂,它还是目前中国唯一允许在婴儿食品中添加的抗氧化剂。目前L-AP的制备方法主要有化学法与生物法两种,但作为食品添加剂的L-AP必须用生物催化法获得。本文详述了化学与生物法制备L-AP的研究进展,详细介绍了目前生物法主要通过优选酶种类与反应介质、优化反应条件和外加辅助场等手段提高产物得率,并进一步介绍了L-AP在各领域中的实际应用现状。     

Effect of Cabbage Phospholipase D Treatment on the Oxidative Stability of Beef Homogenate and Egg Yolk Phosphatidylcholine Liposomes

The possibility that enzymatic hydrolysis of phospholipids increases the oxidative stability of muscle food was examined using cabbage phospholipase D (PLD). As judged by the amounts of thiobarbituric acid‐reactive substances and carbonyl content, treatment of meat homogenate with 500 ppm (840 units) PLD increased its oxidative stability during storage at 4°C for 7 d, as compared to the nontreated ones. The thin‐layer chromatographic analysis confirmed the formation of phosphatidic acid (PA) in the 500 ppm (840 units) cabbage PLD‐treated samples. In a nonheme and heme iron‐induced lipid oxidation of egg yolk phosphatidylcholine liposomes, cabbage PLD treatment also improved their oxidative stability. Cabbage PLD treatment is, therefore, likely to improve the oxidative stability of meat homogenate via PA generation.     

酶制剂在食品保鲜中的应用

现将酶制剂的一般特性 ,酶制剂保鲜的特点 ,以及主要酶制剂 (溶菌酶、葡萄糖氧化酶 )在食品保鲜中的新应用作一介绍 ,并展望酶制剂作为保鲜剂的发展前景。     

抗性淀粉最新研究进展

抗性淀粉由于在食品加工中的功能特性而日益成为现代营养学和食品科学领域研究的热点。综述了近年来抗性淀粉在生理功能和制备方法等方面的研究进展及其在食品中的应用，并对未来的研究前景进行了展望。     

多糖-蛋白质酶促共聚物研究进展

蛋白质和多糖作为食品主要组成中的生物活性大分子,在食品体系中起重要作用。近年来,研究人员试图通过蛋白质与多糖结合进而改善其功能特性。酶促交联方式作用条件温和,反应速率较快,反应产物无毒害作用,并能赋予多糖和蛋白质新功能。因此,主要介绍三大酶促反应体系(过氧化物酶、微生物转谷氨酰胺酶、漆酶)作用原理及多糖与蛋白质酶促交联产物表征技术,为多糖-蛋白质酶促交联产物在食品体系中的应用提供思路。     

食源性ACE抑制肽的研究进展

详尽阐述了具有降血压作用的血管紧张素转化酶抑制肽的食物来源、制备、酶法加工工艺流程及其前景展望。