高产洛伐他汀红曲菌的选育及其在红腐乳中的应用

硫酸软骨素酶（ChSase）是一类能将硫酸软骨素（CS）催化裂解为小分子多糖的酶,根据结合的底物种类可分为ChSase ABC,ChSase AC,ChSase B和ChSase C。将普通变形杆菌（Proteus vulgaris）KCTC 2579的硫酸软骨素酶ABC I（ChSase ABC I）与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合表达,构建了pMAL-c2x-ChSase ABC I重组载体,并成功在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)宿主中高效表达。将麦芽糖结合蛋白-硫酸软骨素酶（MBP-ChSase）ABC I固定在聚苯胺载体上,制备生物传感器,并利用循环伏安法对其进行检测。结果表明,MBP-ChSase ABC I酶活和比酶活分别为3 180 IU/L发酵液和76 IU/mg蛋白。选择硫酸软骨素A（CS A）作为酶的反应底物,在最适反应条件下,反应的峰值电流与CS A在浓度0.1 nmol/L～0.1 μmol/L范围内呈线性关系。该生物传感器对底物反应迅速,具有较高的灵敏度,可以进行有效检测。     

不同连接肽在硫酸软骨素酶 ABC I重组表达中的应用研究

硫酸软骨素酶ABC I（ChSase ABC I）是一类能够将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺多糖降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。该研究将硫酸软骨素酶ABC I基因与麦芽糖结合蛋白（MBP）基因分别用FFFFF和RRRRR两种连接肽连接，并克隆到pMAL-c2X载体上，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)高效表达。结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为716.5 IU/L发酵液和1.15 IU/mg蛋白，重组酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为741.0 IU/L发酵液和1.13 IU/mg蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子质量均为130 kDa，并且都为可溶性蛋白。     

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究硫酸软骨素酶的性质

本文运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)研究了RC3菌株所产硫酸软骨素A酶(CSAase)的部分酶学性质。通过对菌株RC3进行菌种活化、扩大培养和发酵产酶培养,再通过对微生物菌体进行超声波破碎获得胞内粗酶液,将其与硫酸软骨素A等体积混合,反应后通过PAGE研究各条件对酶活力的影响。结果表明,RC3菌株所产硫酸软骨素A酶的最适反应温度为20~40℃,最适pH值为8.0,镁离子是该酶的激活剂,铜离子和锌离子是该酶的抑制剂,钾离子、钙离子、钠离子、锰离子和钡离子对该酶活力没有显著影响;当镁离子浓度为10mM时对该酶表现出最强的激活作用;当铜离子和锌离子的浓度为5mM时对该酶活力表现出强烈的抑制作用;在上述最优条件下,该酶作用4h后获得的低分子量产物比大分子CSA具有更好的抗氧化活性。上述研究结果对该CSAase的应用奠定基础。     

细菌软骨素合酶

软骨素为糖胺聚糖家族一员,是某些细菌产生的荚膜多糖成分,也是动物体内合成硫酸软骨素的前体.细菌软骨素合酶的发现引起了广泛关注,因为此酶的应用可使通过化学或生物修饰生产硫酸软骨素及其类似物成为可能.本文对现已发现的细菌软骨素合酶系统作一综述.     

细菌软骨素合酶

软骨素为糖胺聚糖家族一员,是某些细菌产生的荚膜多糖成分,也是动物体内合成硫酸软骨素的前体。细菌软骨素合酶的发现引起了广泛关注,因为此酶的应用可使通过化学或生物修饰生产硫酸软骨素及其类似物成为可能。本文对现已发现的细菌软骨素合酶系统作一综述。     

同时测定软骨酶解物中硫酸软骨素及透明质酸含量的高效液相色谱法的建立

为了准确快速同时测定软骨酶解物中硫酸软骨素和透明质酸含量，以半乳糖胺和葡萄糖胺为测定目标物，通过优化色谱条件和方法性试验，建立了一种高效液相色谱的测定方法。使用ZORBAX C18柱分离，用乙腈和乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.00 mL/min，在波长250 nm下测定。方法性试验表明，硫酸软骨素和透明质酸的质量浓度在100~500 mg/L范围与峰面积线性关系良好，其中硫酸软骨素的检出限为0.948 mg/L，重复性偏差0.089%，平均回收率99.71%，相对偏差0.35%；透明质酸的检出限为0.027 mg/L，重复性偏差0.045%，平均回收率97.74%，相对偏差0.92%。与传统方法相比，该法具有受杂质干扰影响小，准确度高，重复性优异，回收率以及精确度高的优势，可以实现准确快速同时测定软骨酶解物中硫酸软骨素和透明质酸的含量。     

牛玻璃酸酶酶学特性的研究

以牛睾丸为原料,对纯化后玻璃酸酶的酶学性质进行研究。结果表明,牛玻璃酸酶水解透明质酸钠的最适pH和温度分别为4.5、37℃,在4⁴5℃酶活稳定性较好。NaCl和BSA浓度分别为0.2、0.45mol/L时具有较高的酶活力。金属离子抑制该酶活力的顺序为,Fe3+>Mn2+>Zn2+>Al3+>Ca2+>K+>Mg2+。硫酸软骨素A浓度为1.2mg/mL时,酶活损失31.08%。硫酸软骨素B浓度为0.012mg/mL时,酶活增加1.36%。硫酸软骨素C浓度为1.2mg/mL时,酶活损失45.07%。肝素在0.012mg/mL时对酶存在抑制作用。人类血清蛋白在0.012mg/mL时可增加1.05%的酶活。半胱氨酸使酶失活。      

高效液相色谱法测定食品中硫酸软骨素

采用高效液相色谱法,通过检测被软骨素酶ABC酶解释放的2种不饱和双糖来测定食品中硫酸软骨素(ChS)。软骨素酶ABC水解ChS产生2种不饱和双糖(6-磺化和4磺化双糖),其在氨基相柱中保留时间分别为6.2和7.3 min。这些双糖产生的峰被用来确定样品中ChS的总量。此方法成功用于市售蛋黄酱、调味料和鱼肉肠的分析。     

C4ST-1在大肠杆菌中的可溶性表达

软骨素-4-O-硫酸转移酶-1 (Chondroitin-4-O-sulfotransferase-1,C4ST-1,EC 2.8.2.5)催化软骨素N-乙酰半乳糖胺(N-Acetylgalactosamine,GalNAc)4号位羟基硫酸化生成硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)。C4ST-1含3对二硫键,在Escherichia coli细胞质内二硫键难以正确形成,故在E. coli中表达时主要以包涵体形式存在。为提高胞内可溶性蛋白质的表达水平,共表达了催化二硫键从头形成的巯基氧化酶(Erv1p)或/和促进二硫键正确折叠的二硫键异构酶(DsbC)。结果表明共表达DsbC可使C4ST-1融合蛋白的胞内可溶性表达水平显著提高,但C4ST-1和Erv1p共表达对胞内可溶性蛋白质的表达影响相对较小。C4ST-1和Erv1p或C4ST-1和DsbC共表达菌株的酶活分别为原始菌株的1.30和2.33倍,活力达到(12.32±0.76) U/L和(21.99±0.42) U/L。挑取同时共表达C4ST-1、Erv1p和DsbC的菌株进行摇瓶水平和3 L发酵罐放大培养,酶活分别达到(29.12±0.66) U/L和49.97 U/L。本研究为C4ST-1的大规模应用奠定了一定的基础。     

酶解法从猪气管中提取硫酸软骨素

以猪气管软骨为原料,利用二次酶解法提取硫酸软骨素,设计正交试验对酶解工艺进行优化,并测定了硫酸软骨素的纯度、含氮量、含氯化物量等主要指标.结果表明:最佳工艺组合条件为温度40℃,酶质量分数1.5％,提取时间2.5h,在此条件下平均得率达到10.98％,纯度达到85.22％.该工艺简便易行,有望为工业生产提供参考.     

高效液相色谱法测定食品中硫酸软骨素

采用高效液相色谱法,通过检测被软骨素酶ABC酶解释放的2种不饱和双糖来测定食品中硫酸软骨素(ChS).软骨素酶ABC水解ChS产生2种不饱和双糖(6-磺化和4磺化双糖),其在氨基相柱中保留时间分别为6.2和7.3min.这些双糖产生的峰被用来确定样品中ChS的总量.此方法成功用于市售蛋黄酱、调味料和鱼肉肠的分析.     

酶法提取人工养殖鲟鱼头中硫酸软骨素的工艺研究

旨在建立用酶法从鲟鱼头软骨中提取硫酸软骨素的工艺,采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的共同酶解,得到硫酸软骨素。通过单因素实验和正交实验研究,结果表明:木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶提取鲟鱼头软骨中硫酸软骨素的最佳工艺为:酶量1.00%(10mg酶/1g软骨粉),提取时间为48h,固/液比为1:14。在此条件下,硫酸软骨素的提取率为47.95%,其葡萄糖醛酸含量为33.86%,硫酸软骨素含量为95.78%,杂质蛋白含量分别为0.89%。另外对硫酸软骨素还进行了IR和UV分析。     

强化前体（UDP-GalNAc）合成路径提高果糖软骨素的生产

硫酸软骨素是一种重要的糖胺聚糖,广泛应用于医药、食品、保健品行业。为了提高硫酸软骨素类似物果糖软骨素的生产,通过过量表达磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)、葡萄糖胺合酶(GlmS),优化融合蛋白glmM-glmS的表达水平,获得了最优工程菌株E. coli K4-H-glmMglmS,并确定了最适IPTG浓度(0.4 mmol/L)以及诱导温度(37℃)。最后,在5-L罐水平下,借助DO-stat补料模式,果糖软骨素的产量达到了3.99 g/L,较原始菌株提高了108.9%,为工业化生产果糖软骨素奠定了基础。     

鮟鱇鱼硫酸软骨素的提取及性质研究

建立了从鮟鱇鱼骨中提取硫酸软骨素的方法,并对提取工艺进行了优化。样品用20%氯化钠碱溶液浸提,pH7·8条件除去中性蛋白,pH2·5除去酸性蛋白,然后用70%(v/v)乙醇沉淀获得鮟鱇鱼硫酸软骨素。本方法硫酸软骨素的得率为3·47%,所得鮟鱇鱼硫酸软骨素产品为白色粉末,纯度为90·94%。对鮟鱇鱼硫酸软骨素的理化性质研究表明,其水分含量为8·88%,氮含量为2·86%,氨基己糖含量为30·12%,葡萄糖醛酸含量为31·40%。从鮟鱇鱼骨中提取出的硫酸软骨素产品电泳实验显示为单点,表明其为单一糖胺聚糖,红外光谱吸收特征显示其为硫酸软骨素C。      

鲟鱼硫酸软骨素提取工艺的研究

以鲟鱼软骨为原料,对鲟鱼硫酸软骨素的提取工艺进行了研究.其方法是先用稀碱提取硫酸软骨素,再用碱性蛋白酶分解去除杂蛋白,然后用乙醇沉淀,将沉淀在60℃下恒温干燥2.5h即得产品.正交试验的结果表明,最佳工艺条件下硫酸软骨素得率为35.70%,其中稀碱提取的最佳工艺为:NaOH为5%、提取温度为40℃、提取时间为4h、液料比为4mL/g;碱性蛋白酶去除杂蛋白的最佳工艺为:加酶量为2%、液固比为5 mL/g、酶解温度为45℃、最佳酶解时间为4.0h.     

鲟龙鱼硫酸软骨素提取工艺优化研究

利用响应曲面法优化提取西伯利亚鲟龙鱼软骨组织提取硫酸软骨素的工艺条件。研究了碱浓度、沉淀时间、乙醇体积对硫酸软骨素提取率的影响,在单因素实验基础上采用Box-Behnken中心组合实验,以碱质量浓度、沉淀时间、乙醇体积为影响因素,以提取率为响应值建立二元多次方程,通过响应面分析法得到优化组合。结果表明,最佳工艺条件为:Na OH 0.5mol/L、乙醇体积1倍、沉淀时间20min,提取得硫酸软骨素产率为57.21%,预测值产率为59.31%。      

响应曲面法优化硫酸软骨素提取工艺条件

采用鸡胸软骨为原料,以硫酸软骨素得率为指标,对超声波辅助碱-酶法提取硫酸软骨素的工艺条件进行研究。首先,通过单因素实验确定了各因素的范围,再应用Box-Behnken中心组合实验设计建立二次多项数学模型,进行响应面分析。结果表明,超声波辅助碱-酶法提取鸡软骨中硫酸软骨素的最佳工艺条件为:碱浓度4%,酶添加量1.4g/L,料液比1000∶5923(g/mL),数据结果显著,硫酸软骨素得率为23.94%,通过紫外光谱检测确定提取物质为硫酸软骨素。     

RC-3产硫酸软骨素酶的条件优化及酶的分离纯化

研究了菌株RC-3产硫酸软骨素酶的最适发酵条件及酶的分离纯化,分别优化了碳源种类、碳源浓度、氮源种类、氮源浓度和NaCl浓度等条件,在最适发酵条件下对RC-3进行发酵培养,收集菌体进行细胞破碎制备粗酶液。粗酶液依次经过Q-Sepharose Fast Flow(QFF)阴离子交换层析与Sephacryl S-1000凝胶过滤层析和高效液相色谱(HPLC)进行逐级分离纯化,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的方法验证纯化酶活力。结果表明,最优碳源为0.5%的岩藻多糖(Fucoidan)加乳糖、最优氮源为1.0%的牛肉膏、NaCl的最优浓度为0.3%,在上述条件下发酵48h,获得的菌体生物量最高,酶活力较优化前提高3倍,达1066.89 U/mL。粗酶经过QFF离子交换层析和Sephacryl S-1000葡聚糖凝胶纯化后获得相对较纯的酶,该酶经过HPLC检测表明主要有2个峰,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了此二峰均具有酶活力。     

鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞抑制作用

探究鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞的生长抑制能力,并初步确定影响结直肠癌细胞生长的主要原因。选取3株具有代表性的结直肠癌细胞Caco-2、HCT-116、SW480,采用CCK-8法测定细胞生长曲线、硫酸软骨素对癌细胞增殖的抑制能力;以其中一株结直肠癌细胞HCT-116为模型,用流式细胞仪测定其周期和凋亡情况,用细胞核染色法观察处理前后细胞形态,结合caspase-3凋亡酶活力的测定,考察鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞的促凋亡能力,并初步确定作用途径。研究结果表明,鲟鱼硫酸软骨素对结直肠癌细胞Caco-2、HCT-116、SW480的增殖具有一定抑制作用,最高抑制率分别为70.94%、90.00%和75.00%,明显高于阳性对照处理组;处理后,细胞周期G1/G0期比例升高至88.56%,S期比例降低至4.47%,阻滞细胞G1/G0期;同时,使用鲟鱼硫酸软骨素处理细胞后,细胞形态发生变化,出现细胞核固缩以及细胞破碎等现象,细胞主要的凋亡酶活力显著升高,酶活力可达1 645 IU/μg,使细胞发生凋亡,凋亡率可达63.73%。研究结果证明,鲟鱼硫酸软骨素具有促进结直肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖的能力。     

细菌脂肪氧合酶酶学性质分析及表达优化

脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶,在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重组表达来源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX,并对其酶学性质进行比较分析。通过对酶学性质分析发现:PaLOX、BtLOX的最适反应温度分别为25和35℃;最适反应pH分别为7.0和7.5。PaLOX的K_cat/K_m较BtLOX高16.7倍,展现出更好的开发应用潜力。为优化PaLOX的可溶性表达,采取了2种优化策略:首先利用乳糖作为诱导剂代替异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),使胞内酶活力提高了1.53倍,可溶表达水平提高了2.41倍;进一步与触发因子(triggering factor,TF)融合表达,TF-PaLOX酶活力提高了1.85倍,可溶表达水平提高3.19倍。该研究通过分析细菌来源脂肪氧合酶酶学性质...