胶体金免疫层析法检测食品中花生过敏原蛋白成分

建立一种简易快速胶体金免疫层析法(GICA)用于检测食品中花生蛋白成分.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒、标记抗花生蛋白成分的抗体,制成免疫层析测试条.食品中花生蛋白成分与测试条上金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条.自制花生抗原标准品并检测该方法的灵敏度,同时检测19种食品中是否含有花生蛋白成分.结果表明:GICA测试条与花生蛋白抗原呈特异性反应.检测自制的花生抗原标准品的灵敏度可达50ng/mL,用GICA试条检测了19种食品中,其中13种食品标签上标注含有花生过敏原成分的食品检测结果均呈阳性,4种食品标签上标注不含花生过敏原成分的食品检测结果均呈阴性,而2种食品标签上没有标注过敏原成分的食品检测呈阳性.     

基于多重连接探针扩增技术的食品中六重过敏原成分检测

基于多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）技术建立了一种六重过敏原成分检测方法,可实现食品中大豆、芝麻、花生、杏仁、榛子和核桃6种成分的同时检测。选取多拷贝ITS基因为靶标基因,设计并合成6组特异性杂交探针。探针经杂交、连接和聚合酶链式反应得到扩增片段,经毛细管电泳分析扩增片段大小可明确区分6种过敏原成分。该体系经20余种相关植物、动物及微生物DNA验证显示其特异性良好,经模拟参考样品验证其检出限为5 mg/kg。30份不同种类市售食品MLPA检测结果表明,该方法性能满足实际样品的过敏原的多重检测。因此,本研究建立的基于MLPA技术的六重过敏原检测方法特异性强、灵敏度高,能够为食品过敏原评估、标识管理和风险控制提供技术支撑。     

时间分辨免疫荧光法测定食物中花生过敏原成分

目的:建立双抗体夹心时间分辨荧光免疫法[Time-resolved Fluoroimmunoassay(TRFIA)]测定食物中花生过敏原蛋白成分,为进出口食品中花生过敏原成分检测和由花生导致的食物过敏性疾病的预防提供技术基础。方法:提取花生蛋白,免疫小鼠制备抗花生总蛋白的多克隆抗体,用该抗体包被酶标板,并用生物素标记该多抗作为捕捉抗体,Eu3+标记的链酶亲和素和以β-二酮体为主的增强液等试剂,建立双抗夹心TRFIA方法,检测该方法的灵敏度,同时用于13种食品中花生过敏原蛋白成分检测。结果:初步地研制出双抗体夹心TRFIA法检测食品中花生过敏原蛋白成分,具有特异性,和其最低检出限为0.1ng/mL,标准曲线在0.1～160ng/mL范围内线性良好;11种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性。     

基于多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术检测加工食品中过敏原成分

该研究基于多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）同时检测开心果、巴西坚果、芹菜、麸质、夏威夷果、芝麻、榛子、大豆、花生、葵花籽、核桃、腰果、杏仁、芥末等14种植物源性的过敏原成分,针对ITS序列设计特异性杂交探针,样本核酸经95 ℃变性后,与探针进行特异性结合,经连接和PCR扩增反应得到不同大小的目标片段,通过毛细管电泳分析目标片段的有无来判断是否含有待测过敏原成分。利用混合探针体系检测单一模板只能扩增出单一扩增峰,表明探针具有高特异性,检测限结果表明,MLPA扩增最低可检出的DNA质量浓度为1 ng/μL。通过20份实际样本的检测,证明该研究基于MLPA建立的加工食品中过敏原成分的检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,可以应用于食品安全监管工作。     

双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分

通过建立双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分,为进出口食品花生过敏原成分检测和由花生导致的食物过敏性疾病的预防提供技术基础.提取花生总蛋白,免疫小鼠制备抗花生总蛋白的多克隆抗体,用该抗体包被酶标板,并用生物素标记该多抗,从而建立双多抗体夹心ELISA法;自制花生总蛋白标准品并检测该方法的灵敏度,同时检测15种食品中是否含有花生蛋白成分.成功地研制出双抗体夹心ELISA法检测食品中花生过敏原蛋白成分,具有特异性,其最低检出限为8ng/mL,标准曲线在8 ng/mL～125 ng/mL范围内线性良好;13种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性.     

时间分辨免疫荧光法测定食物中鸡蛋过敏原蛋白成分

目的:建立双抗体夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA)用于测定食物中鸡蛋过敏原蛋白成分,为进出口食品鸡蛋过敏原成分检测提供技术基础.方法:提取鸡蛋过敏原总蛋白,免疫小鼠获得多克隆抗体,并以此抗体包被酶标板,采用生物素标记抗鸡蛋过敏原总蛋白抗体、Eu3+标记的链酶亲和素和以β-二酮体为主的增强液等试剂,建立双抗夹心TRFIA方法,用于检测10种食品中是否舍有鸡蛋蛋白成分.结果:鸡蛋总蛋白SDS-PAGE显示带大致有10条,其中主要条带有4条,分子量分别为71、55、38、14kDa;成功地研制出双抗体夹心TRFIA法检测食品中鸡蛋过敏原蛋白成分,具有特异性,其最低检出限为0.625ng/mL,标准曲线在12.5～640ng/mL范围内线性良好;8种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性.结论:初步建立了检测食品中鸡蛋过敏原蛋白成分的双抗体夹心TRFIA,具有较好的特异性和灵敏度;该方法对于未标注鸡蛋过敏原成分的食品检测具有一定的实际应用价值.     

两种PCR方法检测食品中花生过敏原Arah1成分

采用套式PCR和荧光实时定量PCR两种方法检测食品中花生主要过敏原Ara h1基因成分,从而推断食品中是否含有花生过敏原成分。根据GenBank提供的花生主要过敏原基因Ara h1 DNA序列(登录号为AF432231)的中一段序列分别设计2对内外特异性引物,扩增目的基因片段来建立套式PCR方法;再用上述内引物扩增目的片段,建立SYBRGreenⅠ荧光实时定量PCR方法,绘出拷贝数-CT标准曲线;并通过这2种PCR方法检测8种食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因成分。套式PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法的标准曲线在3×102至3×108 copies范围内线性关系良好,R2值为0.993 5,检测低限设定为3×103 copies。2种方法检测8种食品样品,结果均与食物过敏原标注内容相符。本研究建立的2种方法具有快速、灵敏等优点,可用于食品中花生主要过敏原基因Ara h1成分的检测。     

可视化膜芯片技术检测常见食源性过敏原成分

目的 建立包括鱼、虾、鸡、鸭、花生、核桃、小麦以及大豆过敏原成分的基因膜芯片技术, 实现对这几种食源性过敏原的同步可视化检测。方法 针对常见食源性过敏物质的成分特异性基因或者过敏原蛋白基因设计特异性的带生物素标记的引物和探针。采用反向斑点杂交(reversedot blot, RDB)结合多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)技术, 最终通过化学显色直观显示检测结果, 实现对多种食源性过敏原的同步可视化检测。结果 所建立的可视化基因膜芯片方法准确性强, 通过单目标物以及多目标物特异性实验, 显示本方法仅对鱼、虾、花生、核桃、大豆等靶标食源性过敏原有特异性反应, 非靶标物检测均为阴性; 通过制备不同质量浓度比的模拟样品考核方法的灵敏度, 经检测, 方法检测灵敏度可达0.1%(质量分数)。结论 所建立的方法可达到可视化、快速、准确地鉴别食品中鱼、虾、花生、核桃、大豆等常见食源性过敏原。     

基于桥接DNA的实时荧光定量PCR高灵敏检测沙丁胺醇

建立一种基于免疫磁珠、桥接DNA与实时荧光定量聚合酶链式反应技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)相结合的高灵敏、特异性检测沙丁胺醇(salbutamol,SAL)的方法,通过抗体特异性识别两个邻位连接探针,在桥接DNA的桥接作用下将两个邻位探针连接形成全长扩增子,以此为模板进行qPCR实现信号放大。结果表明,方法检测SAL的线性范围为1.0×10^-2 ng/mL^1.0×10^3 ng/mL,检出限为1.2×10^-2 ng/mL,测定自来水及人工尿液样品中SAL的加标回收率在87.1%~111.7%之间。通过免疫磁珠提高检测的效率,通过桥联DNA提高特异性,通过变温扩增提高检测方法的灵敏度以及适用性,搭建高特异性、通用的检测平台,实现对沙丁胺醇的高灵敏检测。     

荧光定量PCR方法检测榛果过敏原成分

目的建立榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法,并将此方法与酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法进行比对实验。方法根据榛果成分oleosin特异性基因设计并筛选合适的引物和探针,优化反应体系和反应条件,建立榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法,对荧光定量PCR方法与ELISA方法检测结果进行分析。结果建立的榛果过敏原成分荧光定量PCR方法特异性良好,可用于榛果过敏原成分的定量检测,但检测灵敏度低于ELISA检测方法。结论所建立的榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度达到10 mg/kg,具有较好的实用性,ELISA检测方法灵敏度高于荧光定量PCR法,但当榛果过敏蛋白被破坏后有可能出现假阴性结果。