N-乙酰神经氨酸合成途径在枯草芽孢杆菌的构建

对食品安全认可的枯草芽孢杆菌进行菌株改造,利用生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸。首先通过基因合成获取来自枯草芽孢杆菌溶源体的P_(holin)启动子并构建了p MK4-P_(holin)-GFP质粒,转入枯草芽孢杆菌,以GFP为报告基因,对P_(holin)及其它常见的强启动子进行了转录效率的比较,然后将优化后的P_(holin)用于构建N-乙酰神经氨酸表达质粒p MK4-P_(holin)-neu BC。研究结果显示:P_(holin)启动子是一种优异的枯草芽孢杆菌组成型强启动子,在利用LB进行发酵培养的实验中,P_(holin)的转录效率为同样方式构建下的P43启动子的2.62倍。通过N-乙酰神经氨酸表达质粒,可以成功地在枯草芽孢杆菌168菌株中实现N-乙酰神经氨酸的重组生产,摇瓶培养中N-乙酰神经氨酸的产量为0.226 g/L。本文为枯草芽孢杆菌进行N-乙酰神经氨酸的工业化发酵生产奠定了研究基础。     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究

采用PCR方法从枯草芽孢杆菌中扩增得到中性蛋白酶基因npr,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22b-npr,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌株。经IPTG诱导,其所含有的中性蛋白酶基因可高效表达。研究不同的表达条件对中性蛋白酶表达水平的影响,发现当培养液的OD_(600)值达到0.6～0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,28℃诱导7h,重组工程菌中性蛋白酶的表达量最高,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子质量约43 ku的特异性蛋白条带。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

利用枯草芽孢衣壳蛋白表面展示β-半乳糖苷酶

分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣壳蛋白CotB、CotC、CotG和CotX的启动子和编码序列与来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)的β-半乳糖苷酶基因bgaB进行重组,构建融合表达cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重组质粒。将4种重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168(trp-),获得了能在芽孢表面展示的重组菌株PB701、PB702、PB703和PB704。经Western blot检测,4种重组菌株均表达了预期分子量的融合蛋白,初步表明β-半乳糖苷酶被锚定在重组菌株的芽孢表面。以oNPG为底物测定4种重组菌株芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的水解能力,得到的酶活分别为0.14、0.06、0.22和0.20 U/mL。     

耐碱性木聚糖酶在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产菌株BP51中克隆得到木聚糖酶基因xynA及其启动子调控序列,将其构建在芽孢杆菌表达栽体pWG03中得到重组质粒pWGXYN.采用同源高效表达策略,以原生质体转化方法将pWGXYN转入短小芽孢杆茵(Bacillus pumilus)BP4756中,获得重组菌株BPSDBY.通过诱导重组茵株中的xynA基因高效分泌表达.使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP4756提高了20倍.此外,对重组表达的木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究.     

重组β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其在糖化反应中的应用

β-淀粉酶(β-amylase,Amy M)是一种重要的工业用酶,广泛应用在啤酒酿造、制糖等行业中。本研究利用Bacillus megatherium DSM 319来源的β-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6051?10)中分泌表达。首先,构建不同单启动子和双启动子介导β-淀粉酶表达的重组菌株,在摇瓶培养条件下,由P43-P43介导的双启动子重组菌株在发酵培养27 h时,分泌β-淀粉酶酶活力最高达2950.76 U/m L;随后研究碳代谢阻遏效应(Carbon Catabolite Repression,CCR)对重组β-淀粉酶表达的影响,发现对分解代谢控制蛋白(Catabolite control protein A,Ccp A)在DNA上顺式调控元件的碱基位点进行定点突变,可以有效缓解碳阻遏效应,β-淀粉酶酶活提高到4663.03 U/mL;最后,将重组β-淀粉酶应用在糖化反应过程中,结果表明麦芽糖转化率可以达到57.62%。综上,本研究成功构建出β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达体系,为工业化生产β-淀粉酶提供了理论数据支撑。     

一种中温淀粉酶在解淀粉芽孢杆菌LT的重组表达

解淀粉芽孢杆菌可用作多种食品工业酶的生产菌株,但其极低的转化效率影响了这类工业菌株的重组改造及优化。通过对1398解淀粉芽孢杆菌和一种地衣芽孢杆菌Jbac基因组的数据分析,发现这些微生物存在IV型DNA限制修饰系统。对这些微生物转化经甲基化和未经甲基化的质粒,证实外源DNA甲基化修饰会降低DNA的转化效率;利用将外源质粒进行相同类型甲基化的这种新转化策略,表达质粒pMK4E-dx被转入解淀粉芽孢杆菌LT中,发酵结果显示,其中重组菌株LT-J1/pMK4-dx和LT-J2/pMK4-dx分泌的中温淀粉酶活达到145.9和153.6 U/mL,分别为原菌株发酵淀粉酶活的3.65和3.84倍。     

通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

本研究通过串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达。通过对几种现有报道的强启动子的比较并对其进行串联操作,确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最高产量。本研究首先在枯草芽孢杆菌WB800中成功构建五种含不同强启动子的重组质粒p SG101(P_(HpaII)),p SG102(PBcapr E),p SG103(Plux S),p SG104(Pgsi B)和p SG105(Pyxi E),实现纳豆激酶分泌表达,并对其纤溶活性进行测定。结果表明,启动子P_(HpaII)介导的纳豆激酶纤溶活性(110.80 FU/m L)明显优于其他四种启动子。通过对启动子P_(HpaII)进行多次串联,成功构建质粒p SG106(P_(HpaII)-P_(HpaII)),p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))和p SG108(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))。数据显示,菌株Bacillus subtilis WB800/p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))纳豆激酶产量最高为213.30 FU/m L,相比单个启动子P_(HpaII),提高了92.51%。通过对五种强启动子的比较以及对其进行串联操作,成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800的高效表达,纤溶活性最高为213.30 FU/m L,与现有相关报道相比有明显优势。     

B625石油蛋白酶在猪皮绒面革脱毛工艺上的应用

目前,上海新兴制革厂猪皮绒面革的酶脱毛工艺是采用枯草芽孢杆菌A·S1398产生的中性蛋白酶,脱毛时间一般为6小时(其中转鼓转动2小时,停转4小时)。为了试验铜绿假单孢菌腺嘌呤营养缺陷型B 625菌株产生的石油蛋白酶进行猪皮绒面革的酶脱毛,我们总结了它在猪正鞋面革上的应用结果,并参照1398蛋白酶的脱毛工艺,对该酶     

启动子替代构建克雷伯氏菌普鲁兰酶高产菌株

应用启动子替代技术将普鲁兰酶产生菌克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HN9的普鲁兰酶基因的启动子替换为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的P43启动子,构建高产酶菌株。通过融合PCR,将由3个DNA片段融合得到启动子替代同源重组片段,该3个DNA片段分别是带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因启动子上游部分同源序列的四环素抗性基因(Tet)的上游片段Tet1、带有枯草芽孢杆菌P43启动子部分上游同源序列的Tet下游片段Tet2和带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因上游同源序列的P43启动子部分序列的Pro。经电转化将同源重组片段导入克雷伯氏菌中,转化子的普鲁兰酶基因表达水平比出发菌株提高10.23~11.45倍,摇瓶发酵酶活力提高8.97~10.52倍。结果表明,应用高效组成型启动子P43替代原始菌株的普鲁兰酶基因的启动子能够显著提高普鲁兰酶基因的表达量和发酵酶活力。     

解淀粉芽孢杆菌的强启动子的克隆与鉴定

利用启动子探针质粒,从解淀粉芽孢杆菌XH7基因组中分离得到1个强度较高的启动子P28,该启动子在大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶酶活为2 350 Miller U/m L,在枯草芽孢杆菌中的酶活为3 340 Miller U/m L。启动子的序列分析表明该启动子由σK因子识别,由2个启动子串联而成,分别为编码羧基末端加工蛋白酶的基因(ctp A)和编码转醛酶的基因(tal)启动子,为芽孢杆菌启动子库提供了一个新的选择。     

一种中性普鲁兰酶的高效表达及重组酶在粉丝制作中的应用

为获得适合粉丝制作工艺的普鲁兰酶,研究了嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)普鲁兰酶基因Gs P在不同枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主菌中的表达及重组酶的应用效果。分别以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢杆菌1A717和蛋白酶基因缺失的菌株WB600为宿主菌,构建了表达Gs P的重组菌,酶活检测和SDS-PAGE分析表明,两种重组菌产生的普鲁兰酶均为胞外酶,分别命名为Gs P1a和Gs Pwb。两种重组酶分别用于粉丝制作,以Gs P1a处理的芡糊制作的粉丝成品断条率接近于0,由Gs Pwb处理的芡糊制作的粉丝断条率高于前者,这可能与宿主菌WB600在发酵过程中产生的α-淀粉酶有关。该研究表明,中性普鲁兰酶是粉丝制作中明矾的理想替代物,酶液中α-淀粉酶活性的去除有利于其应用性能的提升。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

重组枯草芽孢杆菌PaE菌株的构建及碳代谢阻遏效应研究

通过基因重组的方法,将枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE（除掉启动子）整合在Paxo1质粒上,然后将重组表达质粒Paxo1-amyE导入枯草芽孢杆菌168菌株基因组中的半乳糖苷酶基因lacZ位点。通过转化筛选和重组基因分析,获得含有重组α-淀粉酶基因的工程菌株PaE。经过添加4 种不同的碳源发酵实验检测,在外加2 g/100 mL木糖诱导的情况下,重组菌株的α-淀粉酶产量均有增加。而且重组菌株在一定程度上能够克服葡萄糖等还原性糖引起的碳代谢阻遏现象,提高了α-淀粉酶产量。     

信号肽编码序列库的构建及耐热乳糖酶的分泌

为了实现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,建立一种较简便的方法筛选能够分泌该酶的信号肽,即针对11种信号肤构建信号肽编码序列库,采用随机筛选方法得到合适的信号肽,构建相应的分泌表达载体和重组表达菌株.结果表明,通过信号肽随机筛选方法获得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE信号肽能够有效引导该酶的细胞外分泌,重组菌株摇瓶培养16h后,上清液中积累的耐热β-半乳糖苷酶活力达到64.02 U/mL,占该酶所表达的总酶活力的29.6％.该信号肽筛选方法可以为微生物蛋白质分泌过程中的信号肽快速选择和优化提供参考.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化

以枯草芽孢杆菌为表达系统,以中温α-淀粉酶为目标蛋白,研究了启动子和信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。分别选取了4种启动子以及8种信号肽来进行筛选,结果表明,启动子PApr E的强度最高,信号肽SPnpr E的分泌效率最好。针对重组菌株1A751Q31进行系统的发酵优化,在72 h发酵液中α-淀粉酶酶活达到380U/m L。在7.5 L发酵罐中进行放大实验,发酵液中α-淀粉酶酶活最高达到853 U/m L。以上研究表明,α-淀粉酶适合在枯草芽孢杆菌中进行表达,同时表明枯草芽孢杆菌是良好的异源蛋白表达系统。     

高效降解游离棉酚菌株的鉴定、安全性评价及发酵工艺研究

本实验利用芽孢杆菌发酵棉籽粕,研究对棉粕中游离棉酚降解率的影响,及对发酵前后饲料营养成分如活菌数、中性蛋白酶酶活和酸溶蛋白等的影响,并对发酵效果较好的菌株进行菌株鉴定、安全性分析及发酵工艺探索。研究发现:可高效降解棉籽粕中游离棉酚含量及改善营养品质的芽孢杆菌为BLCC1-0039,游离棉酚的测定方法确定为高效液相色谱法;菌株形态观察和生理生化鉴定并结合其16S rDNA序列,初步确定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);枯草芽孢杆菌杆菌BLCC1-0039的体内安全性评价,发现未对实验小鼠造成形态和活动异常,也未观察到脏器器官病变,初步确定了枯草芽孢杆菌杆菌BLCC1-0039的体内安全性;枯草芽孢杆菌BLCC1-0039发酵棉籽粕提高发酵料的酸溶蛋白含量和中性蛋白酶活性并有效降低游离棉酚含量:发酵48 h时,发酵棉籽粕酸溶蛋白为26.96%,中性蛋白酶活性为3897 U/g,游离棉酚降解率为97.81%。     

含抗菌肽基因的天然质粒在枯草杆菌中的表达

侧孢短芽孢杆菌抗菌肽具有高效、广谱、稳定的抗菌活性,该抗菌活性与其内源质粒密切相关。为研究侧孢短芽孢杆菌含抗菌肽基因质粒异源表达的可行性,本研究中将侧孢短芽孢杆菌S62~-9的天然质粒电转枯草芽孢杆菌Wb800受体细胞,筛选阳性转化子并对其表达产物性质进行研究。得到了产生抗菌活性产物菌株Z4,发酵6 h后开始产生抗菌物质,12~20 h产量达到最大,达620.96 AU/m L。Tricine~-十二烷基硫酸钠~-聚丙烯酰胺凝胶电泳看到S62~-9质粒在枯草芽孢杆菌中得到了成功的表达,反相高效液相色谱分析Z4表达产物含有与侧孢短芽孢杆菌抗菌肽相同物质。该物质抑菌谱广,稳定性好:对于G~+、G~-和真菌均有抑菌活性,而且对于G~+菌株的抑菌效果优于G~-菌株和真菌,121℃处理20 min后的效价保留率约为90%,100℃处理60 min后仍有81%的活性保留;p H 2~12的范围内效价保留率基本不发生变化;对蛋白酶较为敏感,胰蛋白酶和蛋白酶K处理后抗菌肽的效价保留率为60%左右,其他3种蛋白酶处理后也有一定程度的降低。本研究获得了抗菌肽的异源表达菌株Z4,为进一步工业生产抗菌肽提供支持,而且为该抗菌肽遗传基因定位于质粒上提供了证明。