克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物中ACE抑制肽的分离纯化与鉴定

为了从克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物中制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,以克氏原螯虾虾头为原料,采用体外模拟肠胃道消化的方法对其进行酶解,以体外ACE抑制率为指标,通过超滤、凝胶色谱、离子色谱、反向高效液相色谱相结合的方法对克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物进行分离纯化与筛选,以期获得纯度较高的ACE抑制肽,并利用电喷雾静电场离子阱串联质谱对其氨基酸序列进行测定,结果表明,克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物中ACE抑制肽主要分布在分子质量低于3 000 u的超滤组分中;经过分离纯化鉴定得到1个新型ACE抑制肽,其分子质量为225 u,肽序列为Pro-Val,半数抑制浓度IC50值为0. 11 mg/m L,与模拟消化产物相比,ACE抑制肽的IC50值纯化了16. 72倍。     

预酶解对玛咖蛋白胃肠消化及免疫调节活性的影响

为探究不同蛋白酶预酶解对玛咖蛋白胃肠消化程度及消化产物免疫调节活性的影响,该研究选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及复合蛋白酶分别对玛咖蛋白进行预酶解,再经模拟胃肠消化得到五组消化产物。利用TNBS法、福林酚法等测定消化产物的得率、水解度、可溶性肽含量及游离氨基酸含量,再以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为模型探究消化产物的免疫调节活性。结果表明,经五种蛋白酶的预酶解,玛咖蛋白消化产物的水解度、可溶性肽含量和游离氨基酸含量分别提高了35%、5%~16%及37%~92%,且消化产物促进巨噬细胞分泌TNF-α的作用无明显降低。经菠萝蛋白酶预酶解得到的消化产物的免疫调节活性最高,该消化产物含有15 154条分子量小于3 000 u的肽段;在经活性评分及分子对接预测的与TLR2和TLR4受体存在相互作用最强的10个肽段中,NPYPFFGFSI的免疫调节活性最高;HOMO分析结果表明该肽的活性位点位于酪氨酸上。上述结果表明预酶解可在不影响玛咖蛋白免疫调节活性的条件下提高玛咖蛋白的可消化性。     

克氏螯虾虾头Protamex蛋白酶水解产物的抗氧化活性和功能性质研究

使用Protamex蛋白酶对克氏螯虾虾头蛋白进行水解,以制备抗氧化活性肽。结果表明:虾头蛋白肽的还原力、Fe2+螯合力和DPPH自由基清除能力与蛋白肽的浓度之间存在量效关系,均随着肽浓度的增大而增大。通过对蛋白肽的分子量分布进行研究发现,95.14%的多肽的分子量小于1000Da。同时测定了酶解产物的功能特性,结果表明pH对虾头蛋白水解物的溶解性、起泡性和乳化性具有显著影响。     

大米蛋白酶解物的ACE抑制活性研究

为了考察大米四种蛋白经模拟体外消化后能否产生ACE抑制活性肽及其活性状况,本研究以大米为原料,Osborne法提取大米四种蛋白。体外模拟胃肠道消化过程,研究消化酶解ACE抑制活性肽产生情况及其活性大小,同时检测酶解产物的水解度和分子量分布。实验结果表明,大米四种蛋白经胃蛋白酶消化30min,酶解产物的ACE抑制活性均达到较高水平,随后经过胰蛋白酶作用,酶解产物的ACE抑制活性下降。大米清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的4h消化产物半抑制浓度IC50值分别为1.45mg/mL、0.91mg/mL、1.19mg/mL和0.75mg/mL,分子量集中在1000u以下,是易于被人体吸收的ACE抑制活性肽。同时,未经酶解的蛋白几乎没有ACE抑制活性。结果说明大米四种蛋白的体外消化酶解物具有不同大小的ACE抑制活性,其中大米谷蛋白消化产物的ACE抑制活性最高,人体正常食用大米蛋白,经胃肠消化可以产生被人体吸收的ACE抑制活性肽。     

咸蛋清蛋白深度酶解工艺优化研究

以咸蛋清为原料,用酸性蛋白酶对其进行酶解,以蛋白回收率和水解度为指标,通过单因素实验考察了酶解时间、加酶量、pH和酶解温度对咸蛋清深度酶解的影响,优化了咸蛋清蛋白深度酶解工艺,并对最佳工艺条件下获得的咸蛋清蛋白酶解液进行肽分子量分布的测定。研究结果表明:咸蛋清蛋白深度酶解最佳工艺条件是:稀释后的咸蛋清调节pH至4.0,酸性蛋白酶的加酶量为0.3%(E/S),温度为55℃,酶解时间为48h;此最佳工艺得到的咸蛋清蛋白酶解液中肽分子量主要为3000u以下,其中分子量为1000~3000u占49.28%,分子量为1000u以下占35.73%。     

马氏珠母贝酶解产物清除自由基活性的研究

利用胰酶、枯草杆菌中性蛋白酶,在50℃、pH为7.0～8.0、料水比1:3的条件下,对马氏珠母贝肉双酶水解4 h制备得到酶解产物及残渣.利用Alcatase 2.4 L、胃蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶对残渣进行再次酶解.结果表明:Alcalase 2.4 L、复合蛋白酶对残渣的酶解效果较好;残渣的复合蛋白酶酶解产物自由基清除活性较强;马氏珠母贝肉酶解产物清除自由基活性较强的组分分子量在1910 u～944 u之间,残渣复合蛋白酶酶解产物清除自由基活性较强的组分分子量在3 472u～834u之间.     

罗非鱼肉的酶法水解控制和复合研究

利用Flavourzyme、Protamex、Alcalase2 4L、Trypsin、Kojizyme、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和虾头蛋白酶对罗非鱼肉进行水解 ,以游离氨基酸态氮含量、TCA可溶性蛋白 (短肽 )含量和水解度为指标对酶解过程进行分析 ,研究了酶法水解的控制条件以及不同酶水解生成产物的特点 ,在此基础上选择控制酶解的方法以得到较高的TCA可溶性蛋白 (短肽 )含量 ,并进行了复合酶解的比较研究。     

虾头酶解制备血管紧张素转化酶抑制肽的研究

实验以虾头为材料,利用Trypsin、Alcalase 2.4L、Protamex、Flavourzyme、Kojizyme、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、与虾头蛋白酶复合酶解制备血管紧张素转化酶抑制肽.以ACE抑制率(I值)、氨基酸态氮含量(Cn值)、和TCA可溶性蛋白(短肽)含量(Cp值)为指标对酶解过程进行分析,说明了酶法水解以及不同酶水解生成产物的特点;在此基础上选择控制酶解的方法以达到较高的产量,其中Protamex与虾头蛋白酶复合后效果最好,酶解3h,最大I值达到83.6%(稀释20倍),Cp值于酶解2h达到最大值为6.35mg/mL.     

南极磷虾ACE抑制肽的酶解制备工艺优化及其稳定性研究

优化建立南极磷虾蛋白源血管紧张素转化酶（Angiotensin-I converting enzyme,ACE）抑制肽的酶解制备工艺,并考察其稳定性。以脱脂南极磷虾粉为底物,以酶解产物的ACE抑制率为评价指标,从六种蛋白酶中筛选出制备南极磷虾ACE抑制肽的最佳蛋白酶为碱性蛋白酶;通过单因素实验和响应面试验优化确定最佳酶解工艺条件为：酶解时间3.4 h、料液比1:7(g/mL)、加酶量1.6%;在此条件下,酶解产物的ACE抑制率为74.37%±0.87%。该ACE抑制肽在温度20～100℃环境下具有良好的稳定性;在中性及弱碱性条件下较稳定,但在pH<7.0和pH>8.0条件下ACE抑制活性显著下降（P<0.05）;经体外模拟胃肠道消化后仍能保持原有活性的86.96%。研究将为南极磷虾蛋白类健康食品和食源性多肽类降压药物的开发提供支撑。     

低值虾制备呈味肽的酶解工艺

为了利用低值虾制备呈味肽,研究了自配复合蛋白酶的酶解工艺。以多种蛋白酶对低值虾进行酶解试验,优选出中性蛋白酶与风味蛋白酶。通过复合配制和呈味肽制备试验,确定优化的组合方式为中性蛋白酶用量3000U/g和风味蛋白酶用量1200U/g,同时分别确定了复合蛋白酶的最佳温度、pH和时间为50℃,7.0和240min。在最佳条件下,短肽(360~1000Da)的得率达到42.93%,且风味良好。     

罗非鱼皮明胶酶解物及其模拟消化产物的抗氧化活性

以罗非鱼皮为原料提取罗非鱼皮明胶,选用风味蛋白酶和胰蛋白酶制备罗非鱼皮明胶酶解物,采用ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基及亚油酸过氧化体系,初步评价罗非鱼皮明胶酶解物的抗氧化活性,再通过模拟体外胃肠道消化实验,结合分子质量分布测定,进一步考察罗非鱼皮明胶酶解物的抗氧化活性。结果显示,在酶解过程中,风味蛋白酶及胰蛋白酶酶解的水解度逐渐升高,在3 h时达到最高,分别达到5.8%和25.36%。在酶解60 min时其TCA可溶性肽得率最高,风味蛋白酶、胰蛋白酶酶解物分别达56.82%和54.44%。通过比较半抑制浓度(IC_50),确定了酶解60 min时风味蛋白酶酶解物的清除DPPH自由基及抑制亚油酸过氧化能力较胰蛋白酶酶解物强。模拟体外胃肠道消化后,酶解物羟基自由基清除活性均显著提高(p0.05),亚油酸脂质过氧化活性明显降低,消化前后样品分子量分布范围均主要集中于3000~5000 Da,消化后风味蛋白酶及胰蛋白酶酶解物3000~5000 Da组分的含量分别提高了45%及13%。以上研究结果表明,罗非鱼皮明胶酶解后制备的明胶水解物具有一定的抗氧化能力,具有潜在的开发价值。     

虾头的内源蛋白酶酶解研究

本实验对近缘新对虾虾头内所含的内源蛋白酶的性质进行了初步研究，在此基础上分析和比较利用内源蛋白酶对虾头的酶解工艺，当固液比1：2，酶解温度60℃，pH值7．06，酶解时间4h，酶解产物中游离氨基酸含量较高：固液比1：2，酶解温度50℃，pH值8．2，酶解时间4h，酶解产物中TCA可溶性蛋白(短肽)含量较高。     

源于地龙蛋白的抗氧化肽鉴定与构效关系

为探究外源蛋白酶预酶解处理对地龙蛋白胃肠消化程度和胃肠消化后抗氧化活性的影响。该研究利用五种蛋白酶制备了不同的地龙蛋白酶解物,然后通过体外胃肠模拟消化探究这些酶解物的水解度、分子量分布和体外抗氧化活性的变化。五种蛋白酶酶解物中,碱性蛋白酶酶解物的水解度最高,为40.8%,其对DPPH、ABTS自由基的清除能力分别为27.36、175.46 μmol TE/g,ORAC值为0.70 μmol TE/mg。碱性蛋白酶酶解物经胃肠消化后的水解度、DPPH自由基清除率、ORAC值相比于地龙蛋白直接胃肠消化所得产物（EWP）分别提高了94.06%、72.21%及120.00%。GHEWP中鉴定出10 823条分子量<3 ku的肽,通过bioware.ucd.ie进行活性阈值评分筛选出活性评分最高的11个肽进行合成,验证活性,其中ATSGFFVY、HCFVLY、HLASGWY、HRYSDF、HYANMY的综合抗氧化能力较好,量子化学计算结果表明：ATSGFFVY、HCFVLY、HRYSDF、HYANMY的活性位点可能分别位于Tyr-8、Tyr-6、Tyr-3、Tyr-2上;HLASGWY的活性位点可能位于Trp-6上。该研究表明碱性蛋白酶预酶解可提高地龙蛋白的消化程度,增强其胃肠消化产物的抗氧化活性。     

豌豆蛋白挤出物制备抗氧化肽工艺优化及其分离

目的:旨在应用响应曲面实验优化挤压豌豆蛋白的酶解条件,以期得到最优的抗氧化肽和准确的酶解预测模型。方法:以O_2~-·清除率为评价指标,利用响应曲面实验优化中性蛋白酶对含水量为25%的豌豆蛋白挤出物的酶解条件,通过透析纯化酶解物,得到抗氧化肽,并采用高效液相测定其分子量。结果:酶解最佳条件:加酶量11.80%、温度37.50℃、pH6.90、底物浓度8.00%,此条件下,O_2~-·清除率为55.29%±0.20%。透析发现分子量小于1 ku的酶解液抗氧化活性最强,达60.18%,其分子量集中在200~800 u左右,为2~8肽。结论:经验证,所建预测模型准确可靠,酶解产物抗氧化性高,可为相关生产和工艺产品开发提供参考价值。且经显著性分析发现透析可显著提高肽的自由基清除率。     

文蛤蛋白抗氧化活性肽的研究

利用正交实验研究了文蛤蛋白分别经木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶作用后酶解物对羟自由基和超氧自由基的清除作用,优化了水解条件,并对最佳清除率下的三种酶解物进行SephadexG50凝胶柱分离,测定酶解物中抗氧化活性肽的分子量分布。结果表明,三种酶酶解文蛤所得的酶解产物对自由基均具有清除作用,水解液中多肽的分子量主要集中在1000以下,分别占图谱面积的51.90%、61.7%和42.07%。     

Alcalase碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备小分子肽的工艺研究

以绿豆为原料,用Alcalase碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备小分子多肽.采用单因素及多因素试验方法优化酶解条件.考察酶解过程中绿豆分离蛋白预处理、料液比、酶解温度、加酶量、酶解时间等对小肽得率的影响.测定水解产物的功能特性,并用液质联用技术(LC-MS)考察酶解得到的小肽的分子量分布范围.结果表明:绿豆分离蛋白预处理条件为95℃处理20 min.酶解最佳条件为:65℃、pH8.5、底物浓度9%、加酶量6 000 U/g、酶解240 min,水解度可达35.86%.经液质联用(HPLC-MS)分析证明水解产物的分子量集中在1 000 u以下.绿豆分离蛋白各功能特性得到很好地改善,表明该酶对绿豆分离蛋白水解效果良好,完全能达到制备多肽的水解度要求.     

calase碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备小分子肽的工艺研究

以绿豆为原料,用Alcalase碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备小分子多肽。采用单因素及多因素试验方法优化酶解条件,考察酶解过程中绿豆分离蛋白预处理、料液比、酶解温度、加酶量、酶解时间等对小肽得率的影响,测定水解产物的功能特性,并用液质联用技术（LC-MS）考察酶解得到的小肽的分子量分布范围。结果表明：绿豆分离蛋白预处理条件为95℃处理20rain,酶解最佳条件为：65℃、pH8．5、底物浓度9％、加酶量6000U／g、酶解240min,水解度可达35．86％。经液质联用（HPLC-MS）分析证明水解产物的分子量集中在1000u以下,绿豆分离蛋白各功能特性得到很好地改善,表明该酶对绿豆分离蛋白水解效果良好,完全能达到制备多肽的水解度要求。     

大豆肽的生产新工艺研究

通过对酶解工序的研究,优化以大豆分离蛋白为原料同时生产两种大豆肽的生产新工艺。实验结果表明:产物大豆肽A的最佳工艺条件为酶解时间4h,体系pH8.0,温度60℃;产物大豆肽B的最佳工艺条件为酶解时间3.5h,体系pH8.5,温度55℃。另外,测定产物A和产物B的分子量分别在440u和650u。     

南极磷虾金属螯合肽蛋白基料的酶解制备工艺优化

建立南极磷虾金属螯合肽蛋白基料制备工艺,拓展南极磷虾蛋白资源应用领域。以脱脂南极磷虾粉为底物,以酶解产物的水解度及Zeta电位为指标,从5种蛋白酶中筛选确定制备南极磷虾金属螯合肽蛋白基料的最优酶为胰蛋白酶;通过单因素试验和响应面试验优化确定最佳工艺条件为:酶解时间2.75 h、加酶量2.50%、料液比为1:3,该条件下蛋白水解度(14.16±0.43)%,与理论值基本一致。酶解产物的Zeta电位(—29.83±0.66)mV,相对分子质量主要分布于3000 u以下,具有金属离子结合能力的氨基酸占总氨基酸的(31.91±0.45)%,是制备南极磷虾金属螯合肽的良好蛋白基料。研究将为南极磷虾蛋白资源的高效精准利用提供科学指导。     

不同蛋白酶水解牛肉蛋白产物的ACE抑制活力比较

以ACE抑制活力和水解度为指标,考察6种常用蛋白酶（复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶）对牛肉蛋白酶解产物的影响,比较不同蛋白酶酶解产物经模拟消化前后ACE抑制活力的变化,并分析了不同蛋白酶酶解产物的分子量分布和感官评价。结果表明：碱性蛋白酶最适于酶解牛肉生产降压肽,其酶解液ACE抑制率为51.19%,消化后活性降低幅度小,消化后酶解液ACE抑制率为39.65%,同时水解度为44.76%,大分子蛋白分解程度高。其次是复合蛋白酶和中性蛋白酶,两者的酶解液在消化前后都具有高ACE抑制活力,消化前抑制率分别为67.97%和62.00%,消化后抑制率分别为37.26%和43.12%,水解度分别为37.47%和36.35%,但大分子蛋白的分解程度较低。感官评价结果表明,不同酶解液的外观、气味和滋味与市售商品差异不大,无明显不良风味产生,可用于食品辅料的生产。