酸性蛋白酶基因Asp在红曲霉中的同源表达及序列分析

从红曲霉基因组中扩增出酸性蛋白酶基因Asp的编码区,构建其同源表达载体p BC-Hygro-Asp并导入到农杆菌GV3101备用。利用根癌农杆菌介导法将重组质粒导入红曲霉,并筛选获得Asp基因同源重组转化子,实现了酸性蛋白酶基因在红曲霉中的同源表达。转化子中酸性蛋白酶基因表达量是野生型菌株的3.30倍,能达到高产酸性蛋白酶的目的。对红曲霉酸性蛋白酶基因序列进行分析,结果显示该基因产物有两个天冬氨酸蛋白酶活性位点,为亲水性分泌蛋白,不参与信号转导,且与赤曲霉酸性蛋白酶有相同进化速率。      

安卡红曲霉酸性蛋白酶分离纯化及部分酶学性质分析

安卡红曲霉（Monascus anka）CICC 40806培养液经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析两步分离纯化,得到纯度较高的胞外酸性蛋白酶,然后对其性质和动力学进行研究。结果表明M.?anka酸性蛋白酶的最适反应pH值为3.0,pH值稳定范围为3.0～7.0,最适反应温度为50?℃,低于50?℃时酶具有较好的稳定性,50?℃时的衰减常数为0.569。M.?anka酸性蛋白酶以酪蛋白为底物时反应活化能为28.85?kJ/mol,相对较低。M.?anka酸性蛋白酶具有一定的耐盐性,当NaCl质量分数为7%时,最适条件下反应时相对酶活力为12%。以酪蛋白、米渣蛋白、牛血清蛋白为底物时,Km值分别为12.48、14.77、20.05?mg/mL,对米渣蛋白和酪蛋白的催化效率相对较高。M. anka酸性蛋白酶可能在米渣蛋白发酵降解中发挥积极作用。     

米曲霉的酸性蛋白酶

米曲霉是我国大豆发酵食品工业上使用的一种重要微生物.日本也用它来生产清酒,我国的酱油、酱、豆豉都是用它来生产的.这些产品主要是利用米曲霉分泌的蛋白酶,包括中性、硷性和酸性蛋白酶。起初很多人都认为中性蛋白酶和硷性蛋白酶对产品的风味、全氮利用率有着极其重要的作用,因而在选用菌种或进行诱变的工作中,都以高     

米曲霉酸性蛋白酶Ap的结构分析

米曲霉(Aspergillus oryzae)酸性蛋白酶与部分商品化的蛋白酶相比,具有对大豆蛋白水解效率高且水解产物苦味弱的特性。作者采用RT-PCR技术克隆获得酸性蛋白酶(Ap)基因,结合生物信息学手段,对Ap进行分析与预测。结果表明:Ap基因对密码子使用频率具有偏好性,特别是第3位密码子对GC碱基的使用频率高,达到74%;编码404个氨基酸残基。Ap属于胞外天冬氨酸蛋白酶。以海枣曲霉(A.phoenicis)的酸性蛋白酶(PDB code:1IBQ)作为模板同源建模结果可知,Ap分子至少能与2个Zn2+结合,内含1个二硫键、163个氢键、35个盐碱。该酶与1IBQ相比空间结构总体相似,部分重要位点(如flap环、转角和ψ-loops)的氨基酸残基较为保守。     

红曲霉白色突变株固态发酵生产酸性蛋白酶的研究

红曲霉白色突变株因不产色素可扩大红曲霉的使用范围,对经紫外诱变后的红曲霉白色突变株(W1)进行固体发酵并对其所产生的酸性蛋白酶的性质进行初步研究.研究表明此酸性蛋白酶最适反应温度为50 ℃,在30～40 ℃下相对稳定;最适反应pH为3.0,在pH 3.0～5.0之间相对稳定;Mn2 、Ag 、K 对酸性蛋白酶有激活作用,Fe3 、Al3 、Mg2 、Cu2 对酸性蛋白酶有一定抑制作用.通过Sephadex-G75凝胶过滤层析及SDS-PAGE蛋白质电泳分析此蛋白酶的相对分子量范围大约在55000～60000之间.     

红曲霉产蛋白酶特性研究

通过对红曲蛋白酶活力的测定初步研究了红曲蛋白酶的特性。实验表明，红曲霉分泌蛋白酶的旺盛期在培养的第4d～6d。红曲蛋白酶的最适反应pH4．0～8．0，在pH5．0～6．0有较好的稳定性。红曲蛋白酶的最适反应温度在35℃-45℃，40℃时酶活力最大。红曲蛋白酶在35℃-40℃有较好的热稳定性。0．5％硫酸铜和0．5％醋酸铅对红曲蛋白酶有抑制作用，0．5％氯化钠对红曲蛋白酶则有激活作用。     

日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用

为研究日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用。将日本曲霉来源的酸性蛋白酶基因(AjproA1)在毕赤酵母中高效表达,经5L发酵罐高密度发酵后测得该酸性蛋白酶酶活力为669.6U·mL^-1,蛋白质量浓度为6.64mg·mL^-1。氨基酸多重序列比对结果表明:该酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶A1家族,与海枣曲霉来源的酸性蛋白酶同源性最高(73%),是一个新型的酸性蛋白酶。采用强阴离子交换层析柱对该酸性蛋白酶进行纯化得到电泳级纯酶,纯化后分析测得该重组酸性蛋白酶(AjproA1)的最适催化条件为pH值3.0,反应温度为45℃,在pH值为3.0~6.0及温度为40℃以下具有良好的稳定性。该酸性蛋白酶对不同蛋白质水解的分析结果表明,该酶底物水解特异性广泛,对酪蛋白组分中的κ-酪蛋白表现出最高水解活力。利用该酸性蛋白酶对猪肉进行处理,发现该酶能够有效降低猪肉剪切力,起到嫩化效果。研究结果旨在为新型酸性蛋白酶的开发及其在肉类嫩化中的应用提供理论参考。     

米曲霉高产酸性蛋白酶菌株的选育

用2%的纤维素酶,35℃下水浴酶解3 h制得米曲霉部分去壁孢子,以它为诱变对象对其进行Licl-微波,DES-超声波复合诱变,并利用酪蛋白平板初筛,三角瓶固体培养测酶活复筛。最终选出1株高产酸性蛋白酶的菌株C2,其产酸性蛋白酶活力是原始菌株的135.0%。     

根癌农杆菌介导酸性蛋白酶在泡盛曲霉中表达的研究

利用Gateway克隆技术快速构建丝状真菌表达载体,以米曲霉α-淀粉酶A启动子(amyB)、α-糖苷酶终止子(agdA)及黑曲霉酸性蛋白酶基因(pepA)分别构建入门载体,以带有潮霉素抗性标记(hygB)的农杆菌双元载体pHGW为目的载体,通过LR连接反应,构建根癌农杆菌介导丝状真菌重组表达载体pHGW-apA。转化泡盛曲霉宿主菌,筛选的转化子经传代培养确定其遗传稳定性,PCR及测序分析表明,hygB和目的基因pepA整合到了泡盛曲霉基因组。转录水平上的RealTime-PCR定量分析、表达水平上的Western Blotting分析以及培养液酶活分析表明酸性蛋白酶基因pepA在泡盛曲霉中得到正确表达。为丝状真菌表达载体快速构建与外源基因在丝状真菌中快速表达提供了可行的方法。     

根癌农杆菌介导酸性蛋白酶在泡盛曲霉中表达的研究

利用Gateway克隆技术快速构建丝状真菌表达载体,以米曲霉α-淀粉酶A启动子（amyB）、α-糖苷酶终止子（agdA）及黑曲霉酸性蛋白酶基因（pepA）分别构建入门载体,以带有潮霉素抗性标记（hygB）的农杆菌双元载体pHGW为目的载体,通过LR连接反应,构建根癌农杆菌介导丝状真菌重组表达载体pHGW-apA。转化泡盛曲霉宿主菌,筛选的转化子经传代培养确定其遗传稳定性,PCR及测序分析表明,hygB和目的基因pepA整合到了泡盛曲霉基因组。转录水平上的RealTime-PCR定量分析、表达水平上的Western Blotting分析以及培养液酶活分析表明酸性蛋白酶基因pepA在泡盛曲霉中得到正确表达。为丝状真菌表达载体快速构建与外源基因在丝状真菌中快速表达提供了可行的方法。      

红曲霉中PKS基因的结构分析

对实验室保藏的一株高产Monacolin K红曲霉菌株及其野生株进行了初步的PKS基因结构分析。扩增得到红曲霉野生株W菌及其诱变株M菌的目的基因序列,并将测序产物和cDNA序列进行比对,确定该段基因序列不含内含子,且诱变株M菌的突变位置不在此段基因上。分别用ProfileScan、SWISS-MODEL预测了该段蛋白的结构域以及三维结构。     

用宇佐美曲霉酸性蛋白酶水解鸡肉的研究

采用宇佐美曲霉酸性蛋白酶水解鸡肉，较详细地考察了温度、ｐＨ值、加酶量、酶解时间等因素对氨基氮浓度的影响。在本文推荐的条件下，酶解液氨基氮浓度可达５．００ｍｇ／ｍｌ，且未见有因过度水解而导致腐臭的现象发生     

碱性蛋白酶水解红曲霉菌体的研究

为了使红曲霉菌体滤渣得到高值化利用,对红曲霉菌体的酶解条件进行研究。采用碱性蛋白酶对红曲霉菌体进行酶解,通过单因素试验和正交试验,确定最佳的酶解条件:酶解pH为8.5,酶解温度为55℃,底物浓度为40g/L,酶量为6×104 U/g.干菌体,酶解时间为20h。该条件下,酶解率为25.28%。     

红曲霉在食品防腐中的应用及发展前景

介绍了红曲霉的有效生理活性物质，红曲霉中的抗菌活性物质具有防腐的功能，尽望了红曲霉防腐剂的发展前景，对红曲霉在食品防腐中的应用及生产技术作了概述。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达与优化

从宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001中克隆木聚糖酶基因xynⅡ,将不含原酶信号肽编码序列的xynⅡ以正确的读码框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建成重组质粒pET-Xn并转化大肠杆菌,得到重组工程菌KN21。通过对其进行IPTG浓度、温度等诱导培养条件的优化后,胞内重组木聚糖酶活力最高达到81.77U/mg。对重组木聚糖酶进行酶学性质研究,显示其最适温度为45℃,最适pH为4.5。      

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达与优化

从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆木聚糖酶基因xynⅡ,将不含原酶信号肽编码序列的xynⅡ以正确的读码框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建成重组质粒pET-Xn并转化大肠杆菌,得到重组工程菌KN21。通过对其进行IPTG浓度、温度等诱导培养条件的优化后,胞内重组木聚糖酶活力最高达到81.77U/mg。对重组木聚糖酶进行酶学性质研究,显示其最适温度为45℃,最适pH为4.5。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析

依据宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001木聚糖酶(XynII)N末端氨基酸残基序列以及曲霉菌密码子的偏爱性和真核生物mRNA在3′端存在Poly(A)等所提供的生物信息,采用RTPCR技术扩增了XynII成熟肽和3′非编码区的cDNA片段,PCR产物直接克隆至pUCmT载体中。DNA序列分析表明,该cDNA全长733bp,其中3′非编码区178bp,成熟肽编码区555bp,编码184个氨基酸。成熟肽基因推导的氨基酸序列同Aspergillusniger、Emericellanidulans以及Trichodermaviride来源的木聚糖酶相比,同源性分别为89%、46%和36%。又进一步对XynII二级结构进行了分析,并通过SWISSMODEL预测了XynII的三维结构。     

高产酸性蛋白酶白曲霉培养条件的优化研究

以实验室保藏的白曲霉菌株为目标菌株，从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析，以提高白曲霉菌株酸性蛋白酶活力为目的，探究高产酸性蛋白酶白曲霉的实验室最佳培养条件。研究结果表明，以麸皮为主要原料，培养基水分添加量为100%，培养基pH值为5，培养温度38℃，培养时间72 h，为该实验菌株的实验室最佳培养条件。     

红曲霉在奶酪生产中的应用

研究了红曲霉在奶酪生产中的应用,通过试验找出了发酵剂及红曲霉培养液添加量及发酵时间对凝乳时间、产率的影响。确定的最佳生产工艺条件为:红曲霉培养液添加量为2%,发酵时间2h。      

红曲霉在奶酪生产中的应用

研究了红曲霉在奶酪生产中的应用,通过试验找出了发酵剂及红曲霉培养液添加量及发酵时间对凝乳时间、产率的影响。确定的最佳生产工艺条件为:红曲霉培养液添加量为2%,发酵时间2h。