β-1,3-1,4-葡聚糖酶研究进展

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）是一类内切型糖苷水解酶,广泛存在于各类微生物及植物中,对谷物β-1,3-1,4-葡聚糖的水解具有重要作用。在食品工业及饲料工业有着广阔的应用前景。目前已有GH16、GH17及GH26 3 个糖苷水解酶家族的β-1,3-1,4-葡聚糖酶结构得到解析。本文针对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源、性质、结构、功能及应用的国内外研究现状进行综述。     

β-1,3-葡聚糖酶的结构与催化性质研究进展

β-1,3-葡聚糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物中,因来源的差异,β-1,3葡聚糖酶的生理功能多样,如参与植物生长发育、提高或诱导抗病性、提供菌体营养、调节真菌细胞壁稳定性和刚性、参与病毒释放和入侵等。酶的结构研究是探索酶催化反应机理、挖掘酶催化特性以及酶理性设计改造的基础。本文对晶体结构研究最充分的GH16家族细菌β-1,3-葡聚糖酶的结构特征及催化机理进行综述,并通过与GH17家族植物来源β-1,3-葡聚糖酶的结构比较,揭示细菌β-1,3-葡聚糖酶的作用机制,为进一步改造和利用该酶,实现其在植物保护、食品和制药等领域的应用提供重要参考。      

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中。本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经SacI线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku。β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃。      

拟青霉WPG-1的鉴定及固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件的优化

从土壤中筛选出一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的耐热真菌WPG-1,经过鉴定为拟青霉属(Paecilomyces sp.)。通过单因素试验优化拟青霉WPG-1固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。结果表明,该菌株产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最佳条件是:以燕麦粉为碳源,蛋白胨为氮源(氮素含量0.2%),初始水分含量70%,初始p H为自然,培养温度45℃为最佳产酶条件。在优化后的条件下培养5 d产β-1,3-1,4-葡聚糖酶水平高达1 324.49 U/g干基碳源。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70%的（NH4）2SO4及DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28.7倍,酶回收率为45.2%。经SDS-PAGE分析,该酶分子量近似54.6KD。酶最适反应pH为5.0,最适温度为50℃。在pH3.0～5.0、温度30～70℃酶活相对稳定。Fe^3＋、Mg^2＋、Mn^2＋以及Cu^2＋对该酶有抑制作用,Zn^2＋、Ca^2＋和Fe^2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

巴伦葛兹类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的表达、酶学性质及结构解析

从克隆巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904中克隆得到一个β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中进行了异源表达,研究了重组酶的酶学性质,进一步解析了该酶的晶体结构。研究结果表明,该酶的最适温度和pH值分别为50℃和7. 5。该酶底物特异性较广,能够水解β-1,2、β-1,3、β-1,4、β-1,6-糖苷键等在内的多种糖苷键,对昆布多糖、大麦β-葡聚糖和地衣多糖等聚糖均有水解作用。晶体结构信息表明,该酶呈现糖苷水解酶(GH) 3家族典型的多结构域结构,其催化口袋由类似(α/β)_5的三明治结构域和(β/α)_8折叠桶结构域中间的loop构成,其中芳香氨基酸残基Trp748侧链提供一1位结合位点,Trp749侧链提供+1位结合位点,Trp131侧链提供+2位结合位点,这些芳香氨基酸残基形成了一个小的口袋和疏水性环境,不利于转糖苷反应。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70％的（NH4）2S04及DEAE--琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28．7倍,酶回收率为45．2％。经SDS--PAGE分析,该酶分子量近似54．6KD。酶最适反应pH为5．0,最适温度为50℃。在pH3．0-5．0、温度30℃-70℃之间酶活相对稳定。Fe3＋、Mg2＋、Mn2＋以及Cu2＋对该酶有抑制作用,Zn2＋、Ca2和Fe2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。以上表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。     

微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质和基因工程研究进展

对微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质,基因克隆和表达等方面研究进展作了综述.     

黄曲霉产胞外β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶的发酵条件优化

研究发现一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值。依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19 g/L、磷酸氢二铵30g/L、吐温-60 21 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0. 5 g/L、KH_2PO_40. 75 g/L、培养基初始pH值8. 0、培养温度38℃、培养时间6d。在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β-1, 3-1,4-葡聚糖酶酶活达155.9 U/mL。水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β-葡聚糖,并直接生成葡萄糖。这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

在大肠杆菌中实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达。将实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因（bgl）进行融合连接到p ET-28a（+）上;通过优化诱导表达条件,28℃、8 g/L乳糖诱导10 h,重组菌E.coli BL21/p ET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/m L,与IPTG诱导的重组菌E.coli BL21/p ET-bgl（583 U/m L）相比,提高了0.87倍。本研究为高密度发酵制备该酶奠定了基础。      

酿酒酵母表面展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究

固定化酶是酵母表面展示技术的1个重要应用方向。本文应用食品级酵母展示表达系统进行表达,成功获得具有生物活性且固定在酿酒酵母细胞表面的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并测定其酶学性质。结果表明,与分泌表达的自由酶相比,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生了改变。其最适温度为60℃,热稳定性增强。50℃保温3 h,对酶活几乎没有影响。60℃保温1 h后的酶活为初始酶活的129.2%。随着该温度下保温时间的延长,酶活迅速下降,保温3h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%;1 h后酶活开始下降;70℃保温3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4~7范围内酶的稳定性较好。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在工业酿酒酵母表面的诱导展示表达研究

基于絮凝素FLO1基因片段为锚定序列,构建以诱导型GAL1启动子介导的表达载体YEP-GMPFAK,并实现以半乳糖为诱导剂,β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母表面的展示表达。酵母转化子发酵实验表明,在pH6.0、50℃培养条件下,经2%半乳糖诱导24 h,表面展示酶活达到最大值322.83 U/g细胞干重。酶学性质测定表明,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有良好的热稳定性。     

β-半乳糖苷酶的研究现状与进展

β-半乳糖苷酶是一种重要的食用生物催化剂,具有催化β-1,4糖苷键水解和转糖苷作用,并被广泛应用于乳糖水解及低聚半乳糖合成。作为糖苷水解酶家族的重要成员,β-半乳糖苷酶在理论与应用方面均积累了丰富的研究成果。作者从酶的家族分布、催化机制形成、分子结构分析及特殊酶学性质发掘等方面对β-半乳糖苷酶的研究现状进行综述,以期为β-半乳糖苷酶催化调控的深入探索与应用开发提供参考。     

产β-葡聚糖酶高产菌株的驯化及筛选

根据刚果红与β-1,3、β-1,4-葡聚糖紧密结合而保持红色的特征,筛选β-葡聚糖酶高产菌株.本实验室保存的黑曲霉QYW-01经紫外诱变和产酶驯化,获得一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉QYW-01A06,在摇瓶条件下发酵液酶活力达2642U/mL,是出发菌株的2.4倍.     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用

酵母β-葡聚糖是一种具有多种生物功能的细胞壁结构多糖,但天然的酵母β-葡聚糖水溶性较差,影响了其在医疗、保健食品和化妆品行业中的应用。作者通过β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312水解酵母β-葡聚糖制备小分子酵母葡聚糖,提高其水溶性。以大肠杆菌为宿主,异源表达β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312。在25℃条件下,添加0.2 mmol/L IPTG诱导后,Gly5m和BT3312的最高酶活分别为1 086 U/mL和2 355 U/mL。酵母β-葡聚糖经过Gly5m和BT3312水解后,溶解率分别提高了2.6倍和2.4倍。采用Gly5m和BT3312共同水解,酵母β-葡聚糖溶解率提高了3.2倍(水溶性酵母葡聚糖的质量浓度为12.5 g/L)。因此,Gly5m和BT3312在提高酵母葡聚糖的水溶性和制备小分子酵母葡聚糖领域具有重要的应用价值。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株筛选、鉴定及酶基因克隆和序列分析

目的:筛选和鉴定β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株并对酶基因进行克隆和序列分析。方法:利用透明圈法从食堂锅炉排水口污泥中分离筛选菌株,并采用形态和生理生化特征鉴定菌株。通过PCR方法扩增酶基因,将其克隆于T-载体,用Sanger双脱氧链终止法测定序列。结果:分离筛选的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株呈长杆状、革兰氏染色可变、兼性厌氧、产芽孢(次端生、孢囊膨大)。生理生化试验结果表明:该菌株与浸麻芽孢杆菌(Bacillusmacerans)最为相近,命名为BacillusspA3。PCR扩增获得的酶基因全长734bp,其中开放阅读框架为717bp,编码238个氨基酸。经Blast分析,该序列与多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)和浸麻类芽孢杆菌(B.macer-ans)相似性较高,分别为98%和82%。结论:成功分离了β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株BacillusspA3,酶基因序列与多粘芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌有较高的同源性。     

来源与加工方式对β-葡聚糖理化特性的影响及其在肠道的降解机理

检索、归纳并分析近年来关于谷物和微生物中β-葡聚糖结构、功能特性及加工方式对其的影响,以及其在肠道中的降解机理和代谢途径的研究文献。综合显示,谷物中β-葡聚糖的分子质量及β-1,3/β-1,4的比例是决定其结构与性质的关键因素,微生物β-葡聚糖多为β-1,3和β-1,6糖苷键构成的支链多糖;加工方式可改变β-葡聚糖的分子质量、溶解性、黏度及功能特性;β-葡聚糖在生物体中,由肠道厌氧微生物酶系统逐步分解为短链脂肪酸,从而起到维持肠道菌群生态平衡、改善机体代谢及调节免疫的作用。该文综合论述了加工方式,对β-葡聚糖生物活性的影响机理对β-葡聚糖的开发提供参考。     

β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在热带水果保鲜中的应用

通过对β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的抑菌性质进行分析,综述了β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在果蔬方面的抗病害研究进展,对β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在热带水果采后保鲜中的作用进行了展望.