CBHⅡ和EGⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达

重构基因cbh2-linker-CDeg4表达的融合蛋白同时获得具有外切葡聚糖酶CBH II和内切葡聚糖酶EG IV 2种催化活性,在纤维素降解等方面有着重要应用。本研究通过overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶(PDC)的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、重构基因cbh2-linker-CDeg4和pdc终止子依次连接,以质粒p PICZαA为基本骨架,构建表达载体p PIC-PCT。采用原生质体转化法将p PIC-PCT和含潮霉素抗性筛选标记的质粒p AN7-1共转里氏木霉。SDS-PAGE分析表明,重构基因cbh2-linker-CDeg4实现了在里氏木霉中的组成型表达,测得重组木霉发酵上清液的CMCNa酶活最高达到4.08 U/m L,是出发菌株的5.55倍,FPA酶活达到0.915 U/m L,较出发菌株提高了43.6%。酶学性质初步研究表明:粗酶液的最适p H为5.0,最适温度为50℃。     

内切葡聚糖酶基因cel7b 在里氏木霉中的同源表达

用里氏木霉（Trichoderma reesei ）作为宿主同源表达内切葡聚糖酶基因。运用聚合酶链反应（PCR）技术从里氏木霉cDNA中扩增得到内切葡聚糖酶基因cel7b序列,并将其连接到载体p18-m2上构建重组质粒,将重组质粒转化到里氏木霉菌株中,通过筛选获得表达内切葡聚糖酶的重组里氏木霉工程菌。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示,发酵液中重组内切葡聚糖酶的分子质量约48 ku。摇瓶发酵结果显示,内切葡聚糖酶在重组里氏木霉中得到分泌表达,发酵液中的内切葡聚糖酶和滤纸酶活分别达到了726 U/mL和28.7 U/mL,分别为出发菌株酶活的2.9倍和1.1倍。玉米芯进行糖化试验结果显示,重组里氏木霉所产酶液糖化玉米芯的酶解得率为81.4%,比出发菌株提高了6.3%。     

绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达

采用粟酒裂殖酵母诱导表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。通过PCR方法从绿色木霉基因组DNA中克隆到长度为1611bp并含有信号肽序列的cbhⅡ基因;将其插入到粟酒裂殖酵母诱导型表达载体pESP-2的Pnmt1启动子下游,得到重组质粒pESP-2-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞中,通过对酵母转化子质粒DNA的PCR和双酶切鉴定,得到了含有cbhⅡ基因的酵母转化子,对转化子进行诱导培养后提取酵母总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测,得到一条约为81kD的目的蛋白条带;利用DNS法对酵母转化子上清液中的纤维二糖水解酶活性进行测定,结果表明,酶活力最大值为165U/mL。以上结果证明:cbhⅡ基因在Pnmt1启动子控制下在粟酒裂殖酵母中成功地获得表达,并且cbhⅡ自身的信号肽可以被粟酒裂殖酵母正确的识别,并将表达产物分泌至胞外。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究

在毕赤酵母中表达康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶基因cbhI。提取经诱导的康氏木霉mRNA,通过反转录及PCR反应扩增纤维素酶cbhI基因cDNA。将cbhI基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,采用电激法将经SacⅠ线性化的重组质粒pPICZαA-cbhI转化毕赤酵母GS115,MD及G418抗性平板筛选cbhI基因高拷贝转化子,并用PCR鉴定转化子。BMMY培养基中加入0.5%甲醇对毕赤酵母进行纤维素酶CBHI诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白相对分子质量约67 kD,pNPC酶活为24.1 U/L,酶蛋白量为0.22 mg/mL,表明,康氏木霉cbhI可以在毕赤酵母中表达,并具有较高活性。     

不同碳源诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

以不同碳源发酵培养康氏木霉,定时测定粗酶液的纤维素酶活:结合mRNA分析,提取诱导培养的菌体总RNA,进行RT-PCR扩增纤维素酶系的主要基因.结果显示,以微晶纤维素为碳源直接诱导培养康氏木霉3d,纤维素酶活力最高,CMC酶活达到17.58U/mL,P-NPC酶活达到11.39 U/mL,FPA酶活达到1.68U/mL;菌体的RNA进行RT-PCR能够较为稳定的扩增出纤维素酶系的主要基因CBH Ⅰ、CBH Ⅱ、EG Ⅰ、BG Ⅰ,推测结构相对完整的纤维类物质微晶纤维素对康氏木霉产纤维素酶诱导活性较高.表明纤维素酶合成的调节发生于预翻译水平,加入诱导物后引起纤维素酶基因转录表达,酶合成和表达调节是协同发生的.     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)基因克隆与表达

绿色木霉Sn-9106是一株分解纤维素能力较强、能利用秸秆固体发酵生产纤维素酶的工业菌株.通常丝状真菌纤维素酶合成受纤维素、槐二糖等的诱导.本研究利用秸秆粉诱导绿色木霉Sn-9106纤维素酶基因,在诱导3.5d时,纤维素酶组分之一——葡聚糖内切酶Ⅰ的mRNA转录达到峰值,收集菌丝提取总RNA,以单链cDNA为模板,PCR扩增获得编码葡聚糖内切酶Ⅰ基因(egl1),去除信号肽序列后构建重组质粒PET-egl1,实现其在大肠杆菌中的表达,所得重组葡聚糖内切酶经组氨酸标签亲和层析纯化得到单一的E-GI蛋白,SDS-PAGE检测为49ku,活力为2.37U/mL.     

以豆渣为基质高产纤维素酶菌株的选育

以豆渣为培养基,通过对里氏木霉Rut C-30进行紫外诱变,经水解圈法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出适合在豆渣中生长,并且产纤维素酶和半纤维素酶活力较高的菌株LX0121。菌株产纤维素酶（FPA）和半纤维素酶活力的变化规律基本一致,在28℃摇床培养4d达到酶活高峰期,酶活分别为5.87U/mL和125.6U/mL。      

里氏木霉bgl1基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

采用cross—over PCR方法将里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因的外显子进行体外拼接,成功获得了剔除两个内含子的β-葡萄糖苷酶基因bgl1;进一步构建了重组质粒pYX-tbgl,并在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303—1A中获得表达,得到的转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长。     

棘孢木霉木聚糖酶Ⅱ结构基因和上游调控区的克隆及分析

作者克隆及分析了棘孢木霉木聚糖酶Ⅱ结构基因和上游调控区,并获得了内源启动子.根据木霉属木聚糖酶Ⅱ结构基因及上游调控区的保守性,以棘孢木霉基因组DNA为模板,进行简并PCR扩增,产物纯化并克隆至T载体,经酶切鉴定后进行序列分析.扩增获得片段长1875 bp,由795 bp的木聚糖酶Ⅱ结构基因和1 080 bp的上游调控区...     

里氏木霉RL-P37尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建

里氏木霉（Trichoderma reesei） RL-P37作为纤维素酶高产菌,被广泛地应用在工业蛋白的生产过程.从基因水平对工业菌株进行分子改造已经成为提升工业菌株生产性状的重要手段.因此,亟需构建适用于基因敲除以及外源蛋白表达的营养缺陷型菌株,特别是可用于基因无痕敲除的尿嘧啶营养缺陷型菌株.本研究以潮霉素为标记,成功构建了里氏木霉RL-P37尿嘧啶营养缺陷型菌株,并得到Southern验证.该菌株在含有1.5 mg/mL 5-氟乳清酸、2 mg/mL尿苷的MM培养基中可以正常生长,并且在不含有尿苷的MM培养基上不能生长.此外,利用粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的pyr4基因对该突变体进行了回补.里氏木霉RL-P37尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建为该菌纤维素酶表达和分泌的机理研究以及后续产酶性能分子改造奠定了物质基础.     

利用造纸污泥产纤维素酶及产酶条件的优化

以预处理后的造纸污泥为研究对象,检测污泥的组分,利用预处理后造纸污泥,培养里氏木霉生产纤维素酶。研究了碳源浓度、通气量、pH值、摇床转速、温度对里氏木霉产酶的影响,优化产酶条件。结果表明,里氏木霉在优化后的产酶条件下,即碳源浓度40g/L、通气量120L/天、pH值4~6、摇床转速180 r/min、第一天30℃、第二天开始28℃培养时间7天,发酵培养所得粗酶液中纤维素酶和木聚糖酶酶活较优化前的有明显的提高。优化后的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶酶活、木聚糖酶酶活分别为87.53U/m L、121.66U/m L、202.45U/m L。     

以豆渣为基质高产纤维素酶菌株的选育

以豆渣为培养基,通过时里氏木霉Rut C-30进行紫外诱变,经水解圈法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出适合在豆渣中生长,并且产纤维素酶和半纤维素酶活力较高的菌株LX0121.菌株产纤维素酶(FPA)和半纤维素酶活力的变化规律基本一致,在28℃摇床培养4d达到酶活高峰期,酶活分别为5.87U/mL和125.6U/mL.     

产纤维素酶里氏木霉的研究进展

里氏木霉在生产纤维素酶方面具有很多优点,如生长环境粗放、稳定性好、产酶效率高、纤维素酶的各组分结构较为合理等。主要介绍了里氏木霉产纤维素酶高产菌株的筛选方法,包括自然育种、诱变育种、原生质体融合、基因工程和酶分子改造等。并对里氏木霉生产的纤维素酶在食品、动物饲料和医药等领域中的应用和前景展望进行了简单阐述。     

里氏木霉产纤维素酶的条件优化及酶学性质研究

本文对里氏木霉产纤维素酶发酵培养条件及对其所产纤维素酶的酶学性质进行初步研究。结果表明,里氏木霉发酵产酶的最佳培养基为:麦麸1.8%、硝酸钠1.3%、碳酸钙0.3%、氯化钠0.2%、磷酸二氢钾0.3%;里氏木霉所产纤维素酶的最适反应条件为:pH 4.0、50℃,金属离子Fe2+、Co2+、Mn2+、Ca2+对酶活有促进作用,而Fe3+、Ag+对酶有抑制作用。经培养基优化后,发酵液上清中的最终酶活为116.64U/mL,是优化前的3.5倍。     

白腐真菌粗酶液对里氏木霉发酵玉米秸秆的影响

研究比较了不同白腐真菌[变色栓菌(Trametes versicolor)、粗毛革孔菌(Coriolopsis gallica)、爪哇漏斗状侧耳(Pleurotus sajor-caju)]预处理玉米秸秆得到的粗酶液对里氏木霉(Trichoderma reesei)产纤维素酶和木聚糖酶及糖化产生的影响。结果表明,3种白腐真菌粗酶液对里氏木霉产酶影响均为降低纤维素酶的酶活力,提高木聚糖酶的酶活力,作用效果依次为变色栓菌爪哇漏斗状侧耳粗毛革孔菌。加入变色栓菌制备的酶液后,里氏木霉产纤维素酶酶活降低60.61%,木聚糖酶酶活增长60.94%;糖化产葡萄糖量降低了38.84%,产木糖量增长了395%。研究证实白腐真菌粗酶液对里氏木霉发酵产纤维素酶和纤维素酶的糖化有抑制作用,对产木聚糖酶和木聚糖酶水解糖化有协同作用。     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

粗壮脉纹胞菌复合多菌种发酵茶粕产纤维素酶的研究

用粗壮脉纹胞菌分别复合东方伊莎酵母、里氏木霉、绿色木霉、乳酸杆菌固态发酵已去除茶皂素的茶粕,通过测定发酵产物中3种纤维素酶：外切葡聚糖酶（C1）、内切葡聚糖酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶（β-G）及总酶滤纸酶（filter paper activity,FPA）的酶活力来探讨其分解粗纤维素的协同作用。粗壮脉纹胞菌和绿色木霉混合发酵产生的C1酶酶活力较粗壮脉纹胞菌单菌发酵提高了51.09%,粗壮脉纹胞菌和绿色木霉复合发酵较单菌发酵延长了其纤维素酶分泌的周期,96 h时FPA酶活力达到2.782 U/g;粗壮脉纹胞菌复合里氏木霉、绿色木霉混合发酵组在发酵10 d后对茶粕粗纤维的最终降解率分别达到了64.19%和61.59%;接种量对单菌和混合菌发酵产纤维素酶影响总体趋势是随着接种量增加酶活力提高,但粗壮脉纹胞菌单菌发酵纤维素酶酶活力在接种量超过9 mL/100 g后开始下降。表明粗壮脉纹胞菌复合里氏木霉、绿色木霉混合发酵降解纤维素具有协同作用。     

复合菌系的构建及其对玉米秸秆预处理的研究

本文研究了芽孢杆菌T_7.0、黑曲霉Z₃⁴和里氏木霉三株菌的产酶情况,并将其进行复合发酵,研究了复合菌的接种顺序、接种比例对酶活力的影响。以葡聚糖内切酶的活力（CMC酶活）和滤纸酶活力（FPA酶活）作为指标,利用解脂假丝酵母预处理玉米秸秆,对预处理秸秆的条件进行了优化。结果表明:复合菌的接种顺序为:同时接种黑曲霉Z₃⁴与里氏木霉,12 h后再接种芽孢杆菌T_7.0;接种比例是:黑曲霉Z₃⁴:里氏木霉:芽孢杆菌T_7.0为2∶1∶2。解脂假丝酵母预处理秸秆的最优条件是:处理时间36 h、接种量2%、秸秆粉碎度30目。经过生物法对秸秆预处理以后,CMC酶活达到404.28 U/m L。      

绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定

采用乳酸菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ 的表达研究。参照GenBank上发表的绿色木霉（Trichoderma viride）cbhⅡ 基因（GenBank登录号：M55080）设计引物并通过聚合酶链式反应克隆获得其cDNA序列长1 441 bp。为了达到表达分泌该酶的目的,在其基因上游序列前添加了大小为80 bp的信号肽序列。进一步通过生物信息学方法将密码子按照乳酸菌的偏好性进行了优化,通过全基因合成获得了优化后的cbhⅡ 基因。将该基因与穿梭表达载体pMG36e连接, 构建原核表达载体pMG36e-S-cbhⅡ ;利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸菌,纯化的重组菌蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,得到一条约为53 kD的目的蛋白条带,与预期大小相符;利用3,5-二硝基水杨酸法测定培养基上清液中水解纤维素酶的活力达到16.7 U/mL,菌体裂解液上清液和菌体沉淀几乎没有酶活力。结果表明,纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别,并成功实现了胞外表达。     

纺织用纤维素酶高产菌种的选育、固态发酵及其应用

原始菌株里氏木霉M277经紫外诱变后,挑选培养基上水解透明圈大的菌株进行初筛、复筛,获得M277-7高产菌株,连续5代稳定产生纤维素酶,CMC酶活高于原菌株30%.发酵后产生的酶液应用在牛仔布上,减量率可以达到5%.