共表达透明颤菌血红蛋白提高脂肪酶在毕赤酵母中的表达

为了克服巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中的溶氧限制,提高外源蛋白的表达量,本文以启动子YPT介导透明颤菌血红蛋白(VHb)在培养过程中组成型表达。同时以启动子AOX1介导的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因作为报告基因,使CALB在甲醇诱导阶段表达。另外,还将绿色荧光蛋白在过氧化物表面表达,将红色荧光蛋白在过氧化物基质中表达以检测信号肽能否定位在相应的位置。最后,将VHb分别在过氧化物酶体表面和基质两个位置表达,以观察表达位置的不同所产生的影响。通过SDS-PAGE和Western Blot分析表明,CALB和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在限氧条件下,重组菌株GS115/ExVHb、GS115/VHbSKL的外源蛋白CALB的表达量比对照菌株GS115/CALB分别提高了27.57%和20.52%。这说明VHb与外源基因共表达可以改善酵母在发酵过程中的摄氧情况,提高外源蛋白的表达量。     

优化密码子及诱导温度提高雪白根霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母密码子的偏好性,通过在线软件对雪白根霉脂肪酶基因(rnl)进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因(rnl-opt)GC含量由原来的46%提高到49%,碱基A,T,C,G均匀分布,减少了AT和GC富集区,适应指数由0.82提升到0.85。将rnl-opt连接到表达载体p PICZαA并转入毕赤酵母X33中。将含有rnl和rnlopt的重组工程菌在摇瓶和50 L发酵罐中进行诱导表达。摇瓶培养条件下,含有rnl和rnl-opt重组工程菌的最大酶活分别为458、956 U/m L。50 L发酵罐培养条件下,含有rnl和rnl-opt重组工程菌的最大酶活和总蛋白浓度分别为14 856、30 500 U/m L和3.61、7.8 g/L。为了进一步提高含rnl-opt重组工程菌的表达酶活,对其在50L发酵罐培养的诱导温度进行优化,当诱导温度为22℃时,含rnl-opt重组工程菌的酶活和细胞湿重均达到最大值分别为39 520 U/m L和461 g/L。相对于30℃,酶活和细胞湿重分别提高了30%和16%。     

透明颤菌血红蛋白基因（vgb）与monellin基因在毕赤酵母中的联合表达

根据酵母偏爱密码子合成了monellin甜蛋白基因和vgb基因,然后构建了2种不同方式表达的载体,胞内表达的pPIC3.5KV和分泌表达的pPIC9KM.电击转化得到重组子GS115/pPIC9KM和GS115/pPIC9KM/pPIC3.5KV,通过PCR、SDS.PAGE及Western blotting检测发现monellin甜蛋白基因和vgb因成功整合进毕赤酵母基因组并成功表达,通过品尝和CO-差示光谱法证实其表达产物具有活性,用southern blotting对6株高产菌株进行拷贝数分析并未发现拷贝数与分泌蛋白产量之间存在明显的正相关.对比发现,含vgb基因菌株比未含菌株高甜度monellin的产量最高提高了20%,菌体密度平均提高了9%.     

敲除ptsG基因及共表达透明颤菌血红蛋白提高大肠杆菌SHMT产量

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG基因,得到ptsG基因缺失菌株BL21(DE3)ΔptsG。构建重组质粒,得到表达大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)工程菌株BL21(DE3)/pET-glyA、BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA,及共表达SHMT和透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)工程菌株BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV。在LB培养基中,BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株与BL21(DE3)/pET-glyA菌株生长情况没有明显差异,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株稳定期的OD 600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.3%,在LBG培养基中,稳定期BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株OD600 nm值比BL21(DE3)/pET-glyA菌株提高了19.4%,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株OD600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.5%。在LBG培养基中,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,与对照菌株BL21(DE3)/pET-28a相比较,两种单表达工程菌株产SHMT活力分别是其6.4倍和7.7倍,共表达工程菌株产SHMT活力是其9.6倍。实验结果表明,敲除ptsG基因能够增加大肠杆菌在含葡萄糖培养基中的生长量及SHMT表达量,共表达VHb能进一步提高菌株生长量和SHMT产量。     

转透明颤菌血红蛋白基因黄芪毛状根急性毒性研究

目的 初步评价转透明颤菌血红蛋白基因(vgb)黄芪毛状根的安全性.方法 对非转基因黄芪毛状根、转vgb黄芪毛状根及黄芪药材进行急性毒性试验.结果 ig转vgb黄芪毛状根的LD50为59.58 g/kg体重,95%可信限为55.97～63.39 g/kg体重,平均可信限为59.58±3.71 g/kg体重.结论 急性毒性实验表明,黄芪甲苷用量相同条件下,转基因黄芪毛状根符合安全用药的规定.     

转透明颤菌血红蛋白基因黄芪毛状根急性毒性研究

目的初步评价转透明颤菌血红蛋白基因（vgb）黄芪毛状根的安全性。方法对非转基因黄芪毛状根、转vgb黄芪毛状根及黄芪药材进行急性毒性试验。结果 ig转vgb黄芪毛状根的LD50为59.58 g/kg体重,95%可信限为55.97～63.39 g/kg体重,平均可信限为59.58±3.71 g/kg体重。结论急性毒性实验表明,黄芪甲苷用量相同条件下,转基因黄芪毛状根符合安全用药的规定。     

优化毕赤酵母X33重组表达球形马拉色菌脂肪酶LIP1

研究人工合成球形马拉色菌脂肪酶LIP1的基因,并成功在毕赤酵母X33中重组表达.利用响应面分析法,构建LIP1的酶活回归方程.由响应面分析,在温度27.0℃,pH值为7.69,酵母提取物浓度1.50％和葡萄糖浓度3.37％时,预测最大酶活为33U/mL.通过实验验证,最后结果为38U/mL.该值与模型预测基本一致.优化后的酶活提高了26.67％.通过响应面的条件优化,可以获得毕赤酵母X33重组表达LIP1的最大酶活.     

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。     

抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。     

透明颤菌vgb基因在地衣芽孢杆菌中表达用于改良α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶是淀粉加工与食品发酵工业上关键酶制剂之一。为了降低高温α-淀粉酶生产过程中所需要的高溶氧水平对设备的要求,进一步提高α-淀粉酶的生产性能,本研究构建同源整合载体pAX01-sacB-vgb,在地衣芽孢杆菌(B.licheniforms)CICC 10181染色体中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)。发酵实验结果表明,在同等溶氧条件下,重组菌比野生菌生物量提高了45.8%,高温α-淀粉酶酶活提高了116.7%,具有良好的工业应用前景。     

毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶发酵条件

在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。     

TLL脂肪酶C末端修饰对其底物选择性的调节作用

本研究以甘油三酯脂肪酶TLL为研究对象,将偏甘油酯脂肪酶AOL的C末端(Y246-H266)与其C末端(I241-P256)替换,获得突变体TLL_CC,并在毕赤酵母X-33中成功地进行了重组表达。乳化橄榄油的水解实验显示,C末端的置换不影响TLL脂肪酶的p H特性,但是TLL_CC的最适反应温度较TLL脂肪酶下降了15℃。这可能意味着长的C末端可以增加酶分子整体的柔性,进而降低其最适反应温度。三油酸甘油酯的水解实验发现,TLL脂肪酶和突变体TLL_CC反应体系中残留的三酯分别为28.31%和48.12%。而酯化合成甘油酯实验显示,TLL_CC催化的反应体系中TAG生成量仅为野生型的56.67%,但DAG的生成量却相同。上述研究表明,TLLC末端的这种置换明显减弱了TLL脂肪酶水解和合成TAG的能力,但并不影响其合成DAG的能力。这说明C末端的氨基酸替换可能对脂肪酶TLL的底物选择性起到调节作用。     

高效产脂肪酶菌株Burkholderia cepacia C1产酶条件优化

从油菜地土壤中分离到一株高效产脂肪酶菌株C1,经鉴定为Burkholderia cepacia。为了进一步提高C1 脂肪酶的产量,对其产酶的发酵条件进行优化。首先采用单因子试验筛选出最佳碳源为麸皮,最佳氮源为蛋白胨。通过Plackett-Burman 设计对发酵产酶的11 个相关因子进行试验,筛选出3 个主效因子,即蛋白胨质量浓度、橄榄油质量浓度及装液量。利用Box-Behnken 试验设计和响应曲面法分析确定主效因子的最优水平,得出产脂肪酶菌株C1 的最优产酶条件：1.50g/100mL 麸皮、1.05g/100mL 蛋白胨、1.63g/100mL 橄榄油、0.2g/100mL K2HPO4、0.05g/100mL MgSO4、初始pH 值为7.0、装液量为30mL。在优化条件下30℃,180r/min 培养72h,脂肪酶活力达到89.65U/mL,比未优化前的28.50U/mL 提高了2.15 倍。     

Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

Thermomyces lanuginosus脂肪酶(简称TLL)是具有重要商业应用价值的脂肪酶之一。运用RT-PCR技术,从Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因组中克隆得到885 bp脂肪酶基因cDNA序列,其结构基因编码蛋白包含292个氨基酸。将脂肪酶基因cDNA序列开放阅读框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了基因工程菌E.coli BL21/pET28b-TLL。诱导表达后SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子量约为32 ku。筛选获得廉价重组菌培养基,表达条件优化结果表明,当OD600约为0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,在28℃诱导培养7 h,酶活达到41 U/mL。