温度、pH及金属离子对丹东对虾消化酶活性影响

以丹东对虾为原料,从肌肉及消化腺中提取消化酶(蛋白酶和淀粉酶),研究其酶学性质。结果表明:(1)丹东对虾肌肉中蛋白酶最适温度为50℃,最适pH为8,反应激活剂为Mg~(2+)、Ca~(2+)和Mn~(2+),抑制剂为Pb~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(2+);(2)消化腺中蛋白酶最适温度为50℃,最适pH为9,EDTA对其有抑制作用,反应激活剂为Ca~(2+)和Mn~(2+),抑制剂为Pb~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(2+);(3)丹东对虾肌肉中淀粉酶最适温度为30℃,最适p H为7,反应激活剂为Mn~(2+),在浓度为20 mmol/L时,激活作用最大,抑制剂为Pb~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(2+);(4)消化腺中淀粉酶最适温度为30℃,最适pH为8,EDTA对消化腺淀粉酶有抑制作用,反应激活剂为Mn~(2+)和Ca~(2+),抑制剂为Pb~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(2+)。     

温度、pH及金属离子对大连虾蛄消化酶活性影响

以大连虾蛄为原料,从肌肉及消化腺中提取消化酶(蛋白酶,淀粉酶),研究其酶学性质。实验结果表明,(1)大连虾蛄肌肉中蛋白酶最适温度为50℃,最适p H为8,反应激活剂为Mg~(2+)、Ca~(2+)和Mn~(2+),抑制剂为Pb~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)。(2)消化腺中蛋白酶最适温度为40℃,最适pH为6,EDTA对其有抑制作用,反应激活剂为Ca~(2+)、Mn~(2+),抑制剂为Pb~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)。(3)大连虾蛄肌肉中淀粉酶最适温度为30℃,最适pH为7,反应激活剂为Mn~(2+),在浓度为20mmol/L时,激活作用最大,抑制剂为Pb~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(2+)。(4)消化腺中淀粉酶最适温度为30℃,最适pH为7,EDTA对消化腺淀粉酶有抑制作用,反应激活剂为Mn~(2+)和Ca~(2+),抑制剂为Pb~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)。     

海参肠组织蛋白酶D的提取及酶学特性研究

本研究以海参肠为原料,采用p H3.0 50 mmol/L甘氨酸-盐酸缓冲体系,按1∶6(w/v)的料液比,在4℃浸提1 h,获得海参肠组织蛋白酶D的粗酶液。以酸变性牛血红蛋白为底物,进行酶活测定,并研究了该酶的酶学性质。结果表明,海参肠组织蛋白酶D粗酶的最适p H为3.0,在p H3.0~7.0之间稳定性较好;最适反应温度为50℃,在4~40℃具有较高稳定性。5 mmol/L的金属离子Mg~(2+)、Ca~(2+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)和K~+对该酶有激活作用,而Fe~(3+)和Fe~(2+)则对其有抑制作用。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对该酶活性有较强的抑制作用。上述结果说明,在本研究条件下提取获得的海参肠组织蛋白酶D粗酶是一种酸性蛋白酶,其组成以天冬氨酸蛋白酶为主。     

Thermotoga neapolitana中α-半乳糖苷酶基因的克隆表达与酶学性质研究

将新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的耐热α-半乳糖苷酶基因经PCR扩增,以p ET-28a为表达载体,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行表达,用0.8 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,采用超声波细胞破碎菌体得到α-半乳糖苷酶。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法获得α-半乳糖苷酶的分子质量约为35 ku。并对α-半乳糖苷酶的酶学性质进行研究,结果表明:该α-半乳糖苷酶的最适反应温度为85℃;最适反应p H值为5.0;在金属离子对酶活影响的研究中发现Al~(3+)、Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Co~(2+)对酶活起到促进作用,Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ag~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)的终浓度达到100 mmol/L时对酶活有较强的抑制作用;具有较好的热稳定性,在95℃处理38 h后仍具有50%的活性。     

一株琼胶降解菌的筛选、鉴定及粗酶学性质

本研究通过初筛、复筛从青岛近海沉积物中分离出一株具有琼胶酶活性的菌株,该菌的最佳发酵时间为26 h,对该菌培养基进行卢戈氏碘液染色后菌落周围出现明显透明圈,镜检观察菌株的革兰氏染色结果表明,该菌为革兰氏阴性菌。经过鉴定,该菌株为不动杆菌(Acinetobacter sp.),命名为Acinetobacter sp.LXK,对该菌的粗酶学特性进行初步研究,结果显示,该酶的最适反应温度为40℃,最适底物浓度为0.5%,最适反应体系p H为8.0,K~+和Ca~(2+)对酶解反应有促进作用,Fe~(2+)、Mn~(2+)和Ba~(2+)对酶解反应有不同程度的抑制作用。     

大菱鲆鱼肉透明质酸酶的酶学特性研究

以大菱鲆鱼肉为原料,经pH4.7的乙酸-乙酸钠缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、透析后获得鱼肉透明质酸粗酶液,并对其酶学性质进行研究。结果表明:鱼肉透明质酸粗酶的最适pH为4.0,最适反应温度为25℃,在(—3~30)℃具有较高的稳定性,浓度为0.15 mol/L的NaCl可使鱼肉透明质酸酶保持较高活性。金属离子Ca(~(2+))、Mg~(2+)、Zn~(2+)对鱼肉透明质酸酶活性具有促进作用,Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe3+对鱼肉透明质酸酶活性具有抑制作用,抑制剂EDTA、L-半胱氨酸和抗坏血酸在一定浓度范围内可较好地抑制鱼肉透明质酸酶活性。双倒数法绘制米氏动力学曲线确定米氏常数Km为0.132 mg/mL,鱼肉透明质酸酶对不同底物的水解能力依次为HA硫酸软骨素A硫酸软骨素C肝素钠。在4℃条件下贮藏32 d,鱼肉透明质酸酶活性损失率为56.48%。     

木聚糖酶基因XynB在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

目的:将来源于Thermotoga maritima的酸性耐高温木聚糖酶基因Xyn B通过密码子优化整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高效表达木聚糖酶Xyn B的毕赤酵母工程菌并研究其酶学性质。方法:通过分子克隆手段构建目的基因重组质粒以及二拷贝重组质粒,并将重组质粒导入毕赤酵母进行发酵表达,用DNS法测定发酵液酶活,并对酵母工程菌分泌的木聚糖酶进行一系列的酶学性质研究。结果:木聚糖酶的最适p H和温度分别为6.0和60℃;在p H4~6之间,稳定性较好,相对比酶活均在80%以上;在60℃和70℃保温2 h残留酶活分别为80%和70%左右;Co~(2+)对木聚糖酶活性有较明显的促进作用,Fe~(2+)、K~+和Zn~(2+)对酶的活性有微弱的促进作用,而Cu~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Na~+对木聚糖酶活性有不同程度的抑制作用。TLC检验该木聚糖酶可以将木聚糖水解为二糖和少量单糖。通过10 L发酵罐发酵,最大酶活达到了8000 U/m L。结论:木聚糖酶在毕赤酵母中实现了高效表达,并获得了木聚糖酶的最适反应条件等一系列酶学性质,该酶性质优良适合用于饲料添加剂。     

云南莴笋尖酪氨酸酶分离纯化及酶学性质

为获得更多成本廉价且易得的酪氨酸酶来源,为云南莴笋尖酪氨酸酶抑制剂的研究提供参考,选取云南莴笋尖为实验材料,通过匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析等方法纯化,获得电泳纯的酪氨酸酶,并对纯化后的酪氨酸酶进行部分酶学性质研究。结果表明,云南莴笋尖中酪氨酸酶的比活力为20.62 U/mg,分子质量约为995.40 k D,亚基分子质量约为65.23 k D。最适反应温度和最适反应p H值分别为60℃和8.0,在p H 6.0~8.0及20~40℃范围内较稳定。最适条件下,以左旋多巴为底物的K_m值为1.567 mmol/L,vmax为0.037 6 μmol/(min·L)。乙醇、异丙醇、正丁醇对该酶活性有不同程度的抑制作用;甲醇、Co~(2+)、Mn~(2+)、Pb~(2+)、Ag~+、Cd~(2+)、Ba~(2+)、Ca~(2+)对该酶活性有不同程度的激活作用,Co~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有显著的激活作用,低浓度的Zn~(2+)、Cu~(2+)、草酸、抗坏血酸对该酶有激活作用,高浓度时有抑制作用。尿素、EDTA、Li~+、K~+、Mg~(2+)对该酶活性影响较小。     

人体肠道中产尿酸氧化酶细菌的筛选、鉴定与酶学性质研究

该文从人体肠道中筛选出1株产尿酸氧化酶菌株,经形态观察及分子生物学(16S r DNA测序)鉴定为彭氏变形杆菌,命名为Proteus penneri JC-5。随后对其所产尿酸酶进行酶学性质研究,实验结果表明,该酶最适作用温度为35℃,热稳定性较差;最适p H 8. 0,在弱碱条件下有较好稳定性; Ca~(2+)与Mn~(2+)对该酶有激活作用,Ca~(2+)激活作用较强,Fe~(2+)、K~+、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对该酶活性有抑制作用。     

凝结芽孢杆菌RY237 β-半乳糖苷酶酶学性质研究

为研究乳品中具有应用价值的乳糖酶,以乳糖为唯一碳源,用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)法,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性达4.98 U/m L,鉴定为凝结芽孢杆菌。研究了乳糖酶的酶学性质,该酶最适反应温度和最适p H分别为50℃和6.0。该酶在温度40~50℃具有良好的稳定性;p H5.5~8.0表现稳定,p H7.0出现酶活峰值。金属离子Ca~(2+)、K+、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Na+、Mg~(2+)对酶活具有抑制作用,Cu~(2+)对酶活具有完全抑制作用,EDTA对酶活具有激活作用。凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶活性高、性能优良,具有应用价值。     

微生物产大豆异黄酮糖苷酶分离纯化的研究

利用离子交换层析法分离纯化了由菌种Absidia sp.SI39d发酵所产的1种高活性大豆异黄酮糖苷酶,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验得到电泳单点的纯酶,并对其酶性质进行了研究。提纯酶的活力达173U/ mL,酶蛋白的分子量为61ku,最适反应温度为40℃,最适pH值为5.0,在20～60℃,pH4.0～7.0之间酶活力相对稳定。Co~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)对酶活性无影响;Ag~+、Cu~(2+)对酶活性有抑制作用;C_([Fe~(3+)])<50mmol/L时,对酶活性无影响;当C_([Fe~(3+)])>50mmol/L时,有抑制作用。该酶的酶反应动力学方程为V=2.07[s]/(1.45+[s])。     

菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质

将菊粉降解菌Paenibacillus sp. Lfos16的菊粉外切酶基因克隆至表达载体p ET-28a (+),转入Escherichia. coli BL21(DE3)中实现了异源表达。利用镍柱亲和层析纯化重组菊粉外切酶,并进行SDS-PAGE检测。重组菊粉外切酶的表观分子质量为87 k Da,经纯化后,重组菊粉外切酶的比酶活为348.30 U/mg。重组菊粉外切酶作用菊粉和蔗糖的酶活分别为259.37 U/m L和592.16 U/m L,I/S值为0.438,且重组酶水解菊粉的主要产物为果糖。重组菊粉外切酶最适作用温度为40℃,且当温度低于30℃时酶活较稳定;最适作用pH为6。Ag~+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)具有显著抑制作用。重组菊粉外切酶对菊粉的K_m为19. 28 mg/m L,Vmax为0.18 mg/(min·m L)。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

苦瓜核糖核酸酶的分离纯化与性质分析

目的:分离纯化苦瓜核糖核酸酶,并进行酶学性质及生物学性质研究,为其生物活性蛋白研究提供依据。方法:采用乙醇沉降、C_(18)反相高效液相色谱、Tricine-SDS-PAGE和等电聚焦等方法分离纯化与鉴定,以酵母tRNA为底物测定核糖核酸酶酶活性。结果 :从苦瓜中分离纯化获得一种核糖核酸酶,命名为MC-RNase。Tricine-SDS-PAGE和C18反相液相色谱鉴定表明该酶具有较高纯度。其N-端氨基酸序列为VNEFDYYQVVLQWQPAT,相对分子质量为14 ku,等电点PI值为8.1;酶学性质表明,该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5,金属离子Zn~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)对该酶均有抑制作用,而Pb~(2+)可以增强该酶活性;细胞试验结果表明,该酶对人正常细胞L-02及肝癌细胞Hep-G2并没有明显的抑制作用。结论:从新鲜苦瓜组织中分离并鉴定出一种新的核糖核酸酶。     

产胶原蛋白酶菌株的构建及性质分析

使用聚合酶链式反应(PCR)法扩增了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens TCCC11319)的胶原蛋白酶基因col,并在枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtillis WB600)中进行表达。收集重组菌株的发酵酶液,以此来分析胶原蛋白酶性质。酶学性质研究表明:酶的最适反应温度为40℃,在30~40℃具有良好的温度稳定性;最适反应p H值为8.0,在pH值7.0~8.0的条件下稳定,表明是一种中性酶;金属离子Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有明显的激活作用,而Mn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)对酶有明显的抑制作用,其中Cu~(2+)对酶的抑制作用最显著。酶学性质的研究结果对胶原蛋白酶在制革固体废弃物处理应用中具有很好的指导意义。     

蓝莓中多酚氧化酶的酶学特性

为分析蓝莓中多酚氧化酶的酶学特性,本文对影响蓝莓多酚氧化酶(PPO)的酶活力的主要因素:p H、温度、金属离子、抑制剂及热稳定性进行了研究。结果表明:蓝莓中PPO最适p H为6.5,最适温度为30℃,Ca~(2+)和Mn~(2+)对蓝莓PPO有抑制作用,Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)对蓝莓PPO有激活作用。柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸及亚硫酸氢钠能抑制PPO酶活,但柠檬酸抑制效果较差。热稳定性实验结果表明:蓝莓果PPO耐热性较差,高温短时可显著抑制PPO酶活性。     

一种Kappa-卡拉胶酶的克隆、表达及其酶学性质研究

将来源于Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株的κ-卡拉胶酶基因克隆到载体p ET-28a上,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。克隆得到的κ-卡拉胶酶基因序列全长1194 bp,编码一个由398个氨基酸残基组成的蛋白酶,该蛋白酶的分子量为48 ku,结构域分析表明该κ-卡拉酶符合GH16家族的特点。对重组κ-卡拉胶酶的酶学性质进行考察:重组κ-卡拉胶酶只能够专一性的降解κ-卡拉胶;该酶的最适温度和pH分别是55℃和pH 9.0,重组酶在40℃保温1 h可保持95.0%的活性,在45℃保温1 h残余酶活与对照比较仍保留60.0%,在pH 8.0~10.0的缓冲液中处理30 min,仍能保持80%以上的酶活力,低浓度的Na+和K+以及1mmol/L的Sn~(2+)、Fe3+、EDTA、DTT、Tween-20、Tween-80和Triton X-100、β-mercaptoethanol、SDS、Urea对重组酶活具有显著的促进作用;而高浓度的Na+和K+以及1 mmol/L的Cd~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)对重组酶活性有不同程度的抑制作用。     

降解β-胡萝卜素双加氧酶的分离纯化及其部分酶学性质

研究了西方许旺酵母菌发酵产生双加氧酶的分离纯化及其酶学特性,并利用该酶降解β-胡萝卜素生成香味物质。通过摇瓶发酵,并对粗酶液进行硫酸铵梯度沉淀、半透膜透析、DEAE-Sepharose离子交换和Sephadax G-100凝胶过滤等处理,得到转化β-胡萝卜素生成香气物质的双加氧酶。实验结果表明,西方许旺酵母菌发酵产生的双加氧酶被纯化了36.43倍,酶活力回收率为21.0%,分子量为55.0 ku。酶的最适温度为40℃,最适p H为8.5;金属离子对降解β-胡萝卜素双加氧酶活力的影响为:Fe~(2+)Mg~(2+)K~+Na~+Mn~(2+)Cu~(2+)Ca~(2+)Zn~(2+)Ag~+。Fe~(2+)和Mg~(2+)能明显增强酶活力,而Zn~(2+)和Ag~+能抑制酶活力;SDS和胃酶抑素对酶活力有显著抑制作用。降解β-胡萝卜素双加氧酶的K_m=8.24×10~(-4)mol/L,V_(max)=2.16×10~(-4)mol/(min·mg)。     

蜡状芽孢杆菌CZ磷酸甘露糖异构酶基因的克隆表达及酶学性质研究

将蜡状芽孢杆菌CZ中的磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)进行克隆,并在大肠杆菌中进行异源表达。将PCR扩增得到的pmi基因与p ET-22b(+)表达载体进行连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株BL21-p ET22b(+)-pmi,并成功表达了重组磷酸甘露糖异构酶。结果显示:克隆得到pmi基因序列全长为948 bp,编码315个氨基酸。通过镍柱His Trap HP亲和层析法纯化得到具有活性的重组酶,其蛋白分子大小约为40.8 ku。酶学性质结果显示:该酶的最适反应温度为35℃,在30~40℃酶活力相对稳定;最适p H为7.0,在弱碱性条件下保存12 h后仍存有50%以上酶活力;不同低浓度的金属离子Ni~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)和Mg~(2+)均对该酶表现出不同程度的激活作用,其中Mn~(2+)对该酶激活作用最显著,当其浓度为1 mmol/L时,激活作用最大,而Co~(2+)对其有明显的抑制作用。     

黑曲霉果糖基水解酶的重组表达及酶学特征分析

目的:果糖基转移酶在新型果糖基衍生品的制备过程中具有重要作用,获得酶活高、性能优良的果糖基水解酶是关键。方法:利用MEGA 4.0以及Clustal X2等软件对黑曲霉的基因组进行分析,遴选了5个果糖基水解酶基因,接着将它们在毕赤酵母中进行了克隆表达,并研究了重组酶的酶学性质。结果:在摇瓶水平上,重组酶Fru1和Fru5的酶活分别为1360和1560 U/m L,远高于目前已报道的果糖基水解酶的酶活。重组酶Fru1的最适反应温度和p H分别为45℃和5.5,EDTA对它有微弱的促进作用,Fe~(2+)、Na+、Co~(2+)、Cu~(2+)和Ca~(2+)会轻微地抑制酶活,该酶对蔗糖既有水解作用,又有转苷活性,还可以水解菊粉中的二糖到五糖;重组酶Fru5的最适反应温度和p H分别为50℃和5.0,Li~+、Na~+和EDTA对其酶活有促进作用,但Fe~(2+)则强烈抑制酶的活性,它还可以水解蔗糖以及菊粉中几乎所有的大分子糖。结论:本研究为果糖基水解酶的工业化生产及其在新型果糖基衍生品制备过程中的应用提供了可能途径。