黑曲霉F0215中β-半乳糖苷酶系的生化特征

通过分子克隆与遗传重组技术克隆及表达黑曲霉F0215来源的全部β-半乳糖苷酶,构建了重组菌GS115(p PIC-bgl A)、GS115(p PIC-bgl B)、GS115(pPIC-bglC)和GS115(pPIC-bglE);通过摇瓶发酵和甲醇诱导培养,制备相应的重组β-半乳糖苷酶BglA、BglB、BglC和BglE。重组酶BglA、BglB、BglC和BglE的最适作用温度分别是60,50,60,50℃;最适反应pH分别为4.0,4.5,3.5,4.5;Mg~(2+)、Ca~(2+)、Na~+和Mn~(2+)对上述酶的活性均有促进作用,Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ni~(2+)、Zn~2、Li~+和EDTA对上述酶的活性均有抑制作用;以ONPG为底物,采用双倒数作图法测得BglA、BglB、BglC和BglE的Km分别是0.43,0.22,0.37 mmol/L和0.46 mmol/L;BglA、BglB、BglC和BglE对乳糖具有单一的特异性,包含水解与转苷两种基本活性;黑曲霉β-半乳糖苷酶的分子结构呈现典型的真菌β-半乳糖苷酶结构特征。在参照基因组中预示存在的β-半乳糖苷酶BglD,在所试黑曲霉菌种中不存在。     

β-半乳糖苷酶的固定化及其在制备低乳糖牛奶中的应用

利用海藻酸钠和壳聚糖两种固定化载体对三种β-半乳糖苷酶(Maxilact酶、Lactozym酶和来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶)进行固定化,研究温度和p H对酶活力的影响,游离酶和固定化酶水解牛奶中乳糖制备低乳糖牛奶,以及固定化酶的重复利用性。结果表明:与游离酶相比较,固定化酶在最适反应温度、最适反应p H、乳糖水解和重复利用性方面均有提高,表现出良好的稳定性。相比之下,壳聚糖固定化酶比海藻酸钠固定化酶的效果好,其中壳聚糖固定化Maxilact酶效果更为突出,该酶的最适反应温度为60℃,最适反应p H为7.0,在相同加酶量的条件下水解牛奶2 h后,乳糖水解率达99.93%,重复利用5次后,乳糖水解率仍能达到99.28%,重复利用性高,可以减少成本。此次研究为利用固定化酶工业化生产低乳糖牛奶奠定了一定的基础。     

β-半乳糖苷酶的固定化及其在乳清行业中的应用

利用海藻酸钠和壳聚糖2种固定化载体对2种β-半乳糖苷酶(Lactozym酶和源于米曲霉的β-半乳糖苷酶)进行固定化,研究了温度和pH对酶活力的影响、游离酶和固定化酶水解乳清中乳糖以及固定化酶的重复利用性。结果表明:与游离酶相比较,固定化酶在最适反应温度、最适反应pH,乳糖水解和重复利用性方面均有不同程度的变化,表现出良好的稳定性。相比之下,壳聚糖固定化酶比海藻酸钠固定化酶的效果好,其中壳聚糖固定化源于米曲霉的β-半乳糖苷酶效果更为突出,该酶的最适反应温度50℃,最适反应pH为3.0,在相同加酶量的条件下水解乳清2 h后,乳糖水解率为72.99%,重复利用6次后,乳糖水解率仍能达到68.58%,重复利用性高,减少成本。研究为利用固定化酶工业化水解乳清中乳糖奠定了一定基础。     

微泡菌ALW1重组β-半乳糖苷酶的异源表达和酶学性质

β-半乳糖苷酶催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,是乳制品加工中重要的酶。该研究将微泡菌ALW1菌株的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达和纯化,研究其酶学性质。结果表明,微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶属于GH1家族,利用Ni-NTA Agarose亲和层析获得的重组β-半乳糖苷酶分子量约为64 ku。重组酶的最适反应温度为30 ℃,最适pH为4.5。温度低于25 ℃、pH 4.0~5.0条件下,β-半乳糖苷酶具有良好稳定性。重组β-半乳糖苷酶对DTT、吐温20和吐温80具有良好的耐受性;离子型去垢剂SDS和CTAB存在时,β-半乳糖苷酶几乎丧失活性。重组β-半乳糖苷酶的Km和Vmax分别为10.98 mmol/L和7.48 U/mg。结构模拟显示,微泡菌β-半乳糖苷酶的催化酸/碱残基和亲核残基分别为Glu186和Glu370。该研究为来自微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶在食品领域的应用奠定理论基础。     

Thermotoga neapolitana中α-半乳糖苷酶基因的克隆表达与酶学性质研究

将新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的耐热α-半乳糖苷酶基因经PCR扩增,以p ET-28a为表达载体,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行表达,用0.8 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,采用超声波细胞破碎菌体得到α-半乳糖苷酶。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法获得α-半乳糖苷酶的分子质量约为35 ku。并对α-半乳糖苷酶的酶学性质进行研究,结果表明:该α-半乳糖苷酶的最适反应温度为85℃;最适反应p H值为5.0;在金属离子对酶活影响的研究中发现Al~(3+)、Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Co~(2+)对酶活起到促进作用,Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ag~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)的终浓度达到100 mmol/L时对酶活有较强的抑制作用;具有较好的热稳定性,在95℃处理38 h后仍具有50%的活性。     

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。     

一种来源于青霉的β-半乳糖苷酶酶学性质研究

从土壤里筛选到20株产β-半乳糖苷酶的菌株,其中β-半乳糖苷酶活力最高的是菌株L7,通过形态学观察和18SrDNA序列分析,得出该菌株为斜卧青霉;并研究了其β-半乳糖苷酶的酶学性质。结果表明:β-半乳糖苷酶最适作用温度为60℃,最适pH为6.0,在60℃以下和pH3.0 7.0有较高的稳定性;Mg2+、Mn2+对β-半乳糖苷酶活性有显著的激活作用,Cu2+、Fe2+、和Zn+对酶活有较强的抑制作用;以ONPG为底物采用双倒数做图法测得Km为6.25mmol/L;经过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,该酶蛋白的分子量约为110kDa。     

米曲霉β-半乳糖苷酶的性质及其水解作用

β-半乳糖苷酶能够水解牛乳和其它乳制品中的乳糖,同时还具有转半乳糖苷作用。本文通过实验分析了米曲霉β-半乳糖苷酶的酶学性质,并证实了其对乳糖的水解作用。     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

高效利用棉籽糖菌种的筛选及酶学性质研究

为筛选出可高效利用棉籽糖的菌种并对其酶学性质进行研究,采用高效液相色谱法测定了棉籽糖含量,平板计数法测定菌种生长量,p NPG法测定α-半乳糖苷酶酶活。结果显示,该实验筛选出屎肠球菌、粪肠球菌和凝结芽孢杆菌3株可以高效利用棉籽糖的菌种,发酵后培养基中棉籽糖剩余含量分别为0、0. 36%和1. 05%(质量分数)。屎肠球菌α-半乳糖苷酶最适p H值为5,最适温度为45℃。粪肠球菌α-半乳糖苷酶最适p H为5,最适温度为50℃。凝结芽孢杆菌α-半乳糖苷酶最适p H为8,最适温度为45℃。所产α-半乳糖苷酶具有较为稳定的酶学性质,可为今后饲料和食品中棉籽糖的去除提供研究方向。     

β-半乳糖苷酶交联酶聚体的制备及酶学性质研究

研究了乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶交联酶聚体(CLEAs)的制备条件和酶学性质,并应用于乳糖为底物催化制备低聚半乳糖(GOS)的反应体系中。结果表明:将β-半乳糖苷酶酶液稀释20倍,按体积比1∶1加入异丙醇,4℃下沉淀30min,加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛,4℃下交联30min,离心洗涤,所得CLEAs的酶活保留达45.77%;与游离酶相比,β-半乳糖苷酶CLEAs的最适p H由7提高至8,最适温度由30℃提高至37℃,p H和温度的适用范围有所拓宽,且37℃下热稳定性提高1倍,具有更高的转糖苷活性选择性,适于制备功能性低聚半乳糖。     

Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及其酶学性质

本文利用大肠杆菌原核表达系统对来源于Geobacillus thermodenitrificans的α-半乳糖苷酶编码基因进行了重组表达,并对该酶的酶学性质进行了研究。结果表明,该α-半乳糖苷酶的分子量为100~110 kDa,以pNPG为底物时,该酶的最适反应温度为70 ℃,最适pH6.0,且该酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性;Hg+、Ag+、Cu2+离子能完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,Fe3+、Mn2+、Zn2+等离子对α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用;以pNPG为底物测得该酶的米氏常数K_m=10.04 mmol/L,最大反应速度V_max=18.25 μmol/min。     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

来源于热泉宏基因组的β-半乳糖苷酶及其特征

研究了在大肠杆菌中克隆和表达来自热泉宏基因组的一个β-半乳糖苷酶基因以及该β-半乳糖苷酶在动物营养中的初步应用。以大理洱源一个65℃热泉微生物宏基因组DNA为模板,克隆得到该基因全序列。根据同源性分析,该β-半乳糖苷酶与Thermotoga lettingae TMO来源的糖苷水解酶(Sequence ID:YP_001471199.1)同源性最高,为71%。重组转化子经诱导所得酶最适反应温度为55℃,最适pH值为7.5,酶液经58℃热处理30min,酶活残留65%以上,该酶能将乳糖或豆粕中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。     

米曲霉β -半乳糖苷酶的定向进化、高效表达及应用

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶（AoBgal35A）,以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体（mAoBgal35A）,经高密度发酵酶活力达4 760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55 ℃,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5 ℃。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。     

耐热乳酸菌的筛选及其β-半乳糖苷酶性质分析

本研究从鸡粪样品中分离高产β-半乳糖苷酶的耐热乳酸菌,经16S r RNA序列鉴定,分离得到的6株菌株均为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。初步分析分离菌株所产β-半乳糖苷酶,其最适p H均为6.5。热稳定性实验发现,菌株MF1567产生的β-半乳糖苷酶在55℃温育1 h,仍保持51.2%的酶活力。分析菌株MF1567的β-半乳糖苷酶氨基酸序列和蛋白质结构,发现该菌株中β-半乳糖苷酶Lac Z存在22个氨基酸替代,其二级结构α-螺旋的比例较高(26.5%)。结果显示,蛋白质一级和二级结构的改变可能是该酶具有较好耐热性的原因。     

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的克隆及其作为食品级筛选标记的研究

为研究嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)作为食品级筛选标记的活性及筛选稳定性,作者从嗜酸乳杆菌基因组中克隆β-半乳糖苷酶基因并在乳酸乳球菌中表达,通过X-gal显色筛选阳性克隆;用X-gal显色筛选方法将重组乳酸乳球菌传60代,并测定β-半乳糖苷酶酶活和比活力。结果显示:通过表达有活性的β-半乳糖苷酶和X-gal显色可成功筛选出阳性克隆菌株;对借助X-gal传60代后的重组乳酸乳球菌进行β-半乳糖苷酶比活力检测,与X-gal筛选的第二代相比没有显著差异(P=0.5920.05),与红霉素筛选比较也没有显著差异(P=0.8820.05)。由此可见,β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记具有较好的活性和稳定性,为以β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记的食品级载体的研究奠定了基础。     

木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较

根据木聚糖酶Xyn43A基因序列,设计特异性引物,以p MD18-T-Xyn43A重组质粒为模板克隆Xyn43A成熟肽基因,将该基因分别克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,分别在大肠杆菌BL21及毕赤酵母GS115中表达。重组酶在大肠杆菌中胞内表达,比酶活力可达61.43 U/mg。重组酶在毕赤酵母中分泌表达,比酶活力可达145.24 U/mg。酶学性质显示,BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重组酶最适温度、p H相同均为45℃、p H 5.0。GS115-Xyn43A温度稳定性、p H稳定性均优于BL21-Xyn43A。     

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的：本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖（Galactooligosaccharides,GOS）提供基础。方法：从多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶（PpBgal42A）基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果：PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适p H和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0～9.5范围内和4～35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31...     

臭曲霉ZU-G1 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为明确臭曲霉ZU-G1分泌的α-半乳糖苷酶的酶学性质,采用硫酸铵沉淀、分子筛层析和阴离子交换层析等方法进行分离纯化.试验结果表明:α-半乳糖苷酶的分子质量136.71 kDa,反应最适pH 5.0,最适温度60℃;在30～40℃环境中热稳定性较好,在pH 6.0环境中酸碱稳定性较好.该酶受Ag+和十二烷基磺酸钠的强烈抑制(抑制率分别为100%和93%)、Cu2+的明显抑制,而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、棉籽糖、乙二胺四乙酸和巯基乙醇对酶活性影响较小.该酶对pNPG的米氏常数Km=33.48 mmol/L,最大反应速度Vmax=238.09 mmol/(L·min).本试验结果为α-半乳糖苷酶在饲料和食品中的应用提供了一定的理论基础.