氨基甲酸乙酯降解酶的基因克隆

提取氨基甲酸乙酯降解菌株基因组DNA,以27f和1492r为引物PCR扩增并测定目的菌株16Sr DNA序列,基因组DNA以Mbo I进行酶切,与BamH I酶切的pUC18连接形成重组载体,将载体转化入大肠杆菌BL21中,构建基因组文库。利用溴麝香草酚蓝筛选培养基上筛选含有氨基甲酸乙酯降解酶基因的重组菌。通过本实验,鉴定出氨基甲酸乙酯降解酶菌株属于蜡样芽孢杆菌。阳性重组菌株可通过含有1%溴麝香草酚蓝的培养基(pH=6.5)筛选出来。     

黑曲霉ZM-8葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

以黑曲霉ZM-8基因组为模板,设计了含有6×His标签和胶原蛋白酶识别位点序列的上游引物及下游引物,通过聚合酶链式反应扩增获得葡萄糖氧化酶（GOD）基因,并与Smal酶切平末端pUC19载体连接,对蓝白斑筛选获得的重组子进行酶切鉴定及测序分析,表明该基因（HQ269422．1）大小为1749bp,编码583个氨基酸。用限制性内切酶Notl切下目的基因,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成表达载体pPIC9K-HisGOD。该重组毕赤酵母表达载体的构建,有望获得高分泌表达、便于纯化的高活性葡萄糖氧化酶,为研制高品质的酶制剂奠定基础。     

植物乳杆菌melA基因的克隆及其作为食品级筛选标记的初步研究

以L. plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表达载体pMG36e-melA。重组表达质粒pMG36e-melA经Sac I和Sph I双酶切和PCR鉴定与预期片段大小相符。结果表明已初步构建了以melA基因为食品级筛选标记的重组载体。     

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

Lactobacillus kefiranofaciens 乳糖酶基因克隆及在毕赤酵母中表达

以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组为模板,PCR扩增得到乳糖酶中LacL、LacM两个大小亚基片段,经EcoRI和SnaBI双酶切后,分别连接pPIC9K质粒,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并验证其核苷酸序列正确。将重组质粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分别电转化毕赤酵母GS115,构建pPIC9K-LacL-GS115重组子和pPIC9K-LacM-GS115重组子,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/mL,具有多拷贝基因的重组子。经反转录PCR验证,cDNA上存在LacL片段,并可检测到乳糖酶酶活达到1.17 U/mL;pPIC9K-LacM-GS115重组子诱导表达72 h后的发酵液上清经SDS蛋白电泳检测到目的条带。     

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

用PCR 方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因,将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K 的α分泌信号开放阅读框的下游,对重组质粒pPIC9K-MalQ 所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶Sal Ⅰ线性化,电穿孔转化到GS115 感受态细胞中,G418 梯度筛选高拷贝转化菌及PCR 鉴定目的基因的整合,1% 甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。     

小牛凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的表达及遗传稳定性研究

目的:构建小牛凝乳酶原乳酸克鲁维酵母分泌型表达载体,表达重组凝乳酶原.方法:通过PCR获得小牛凝乳酶原cDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pKLAC1 α结合因子分泌信号下游,得到重组载体pKLAC1-prochymosin.SacII线性化后氯化锂转化乳酸克鲁维酵母GG799,用含5mmol/L乙酰胺的YCB固体培养基筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因,利用特异性引物筛选多拷贝转化子.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析并检测凝乳酶的活力,通过检测阳性转化子产凝乳酶的活力考察其遗传稳定性.结果:经测序及PCR证实,凝乳酶原cDNA准确插入酵母表达载体pKLAC1中,转化后重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明凝乳酶的分子量约为36kD,酸处理后测得培养基中凝乳酶的酶活为83SU/ml,阳性转化子遗传稳定性好.结论:成功构建出酵母表达载体pKLAC1-prochymosin,在培养基中获得分泌的重组凝乳酶原,经过酸处理后凝乳酶原转化为有活性的凝乳酶.     

三角褐指藻PtCryP基因的克隆及敲除载体构建

文章旨在获得三角褐指藻中隐花色素CryP的全长序列并进行生物信息分析,且利用CRISPR/Cas9系统的pKS diaCas-sgRNA质粒,通过质粒酶切、引物退火、连接重组质粒,成功构建了PtCryP三角褐指藻的敲除载体,并通过DNA测序确定插入了sgRNA序列。PtCryP基因的开放阅读框全长为1575 bp,编码524个氨基酸,预测的等电点8.30,理论分子量58.98 kD。通过结构域分析,隐花色素蛋白的典型结构域存在于PtCryP蛋白中。本研究首次构建了三角褐指藻PtCryP的CRISPR/Cas9敲除载体,为下一步三角褐指藻CryP的表达和功能研究奠定基础。     

植物乳杆菌降胆固醇Lp10菌株的rhaD基因敲除株的构建

以转录组数据为依据推测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中rhaD基因参与胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)合成代谢中的鼠李糖代谢过程,从而通过调节胞外多糖合成并利用其吸附作用达到降胆固醇效果。为了进一步验证rhaD基因的功能,本论文研究利用同源重组技术,构建rhaD基因敲除载体,采用电击转化方法将构建的敲除载体导入植物乳杆菌Lp10菌株感受态细胞,并在抗性平板上筛选转化子,以转化子的基因组DNA为模板进行PCR及测序鉴定,再利用邻苯二甲醛法测定突变株与初始菌株的降胆固醇能力。结果表明,敲除载体pNZ5319-rhaD被成功构建,测序结果显示rhaD基因被成功敲除;敲除菌株的降胆固醇能力略有上升。本论文研究结果不仅为植物乳杆菌基因敲除载体的构建提供了实验技术支持,同时为植物乳杆菌降胆固醇相关功能基因的验证分析奠定了理论依据。     

杂合抗菌肽MgJ基因真核表达载体的构建

根据Magainin-Ⅱ和Japonicin-Ⅱ的基因序列,用一个铰链结构ser-ser-gly-ser-gly-ser相连,结合巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子设计出杂合抗菌肽基因MgJ.通过重叠聚合酶链反应(overlapping PCR)法合成基因片段,再将基因按正确的阅读框架定向克隆至巴斯德毕赤酵母的高效表达载体pPICZα A上.经酶切鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5α菌落中含有插入MgJ基因的重组质粒pPICZαA-MgJ,结果表明,成功构建了杂合抗菌肽MgJ基因真核表达载体pPICZαA-MgJ.     

德式乳杆菌保加利亚亚种分解代谢控制蛋白CcpA基因敲除突变株的构建

在革兰氏阳性菌中,分解代谢控制蛋白(Ccp A)是一种参与碳代谢和氮代谢的多效调控蛋白。利用同源重组技术,以德式乳杆菌保加利亚亚种为研究对象,构建Ccp A基因敲除突变株。首先以德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842基因组DNA和质粒p BR322为模板,扩增Ccp A基因和四环素抗性基因(Tet),然后分别将Ccp A基因和Tet基因连接到载体p Back Zero-T Vector上,再对中间载体p Back Zero-Ccp A和p Back Zero-Tet进行双酶切,回收纯化双酶切后的目的片段并连接获得Ccp A基因敲除的重组载体p CT。通过同源重组筛选Ccp A基因敲除突变株,菌落PCR和测序鉴定结果均显示Ccp A基因敲除突变株构建成功,这为阐明该调控蛋白在德式乳杆菌保加利亚亚种代谢过程中的作用奠定了基础。     

杂合抗菌肽Py-Sα真核表达载体的构建

本文根据抗菌肽Polyphemusin I和Spinigerinα的氨基酸序列,结合Pichia pastoris;偏爱密码子,人工设计合成杂合抗菌肽Py-Sα基因。按照正确的阅读框架将其定向克隆至真核表达载体p PICZαA上。经PCR及双酶切鉴定,所转化的宿主细胞中含有插入Py-Sα的重组质粒p PICZαA-Py-Sα,结果成功构建了杂合抗菌肽Py-Sα的真核表达载体。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析

为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因的表达模式和功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T_0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。     

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素脱氢酶(Pds)是番茄红素合成的关键酶,本研究通过PCR 法获取pds 基因和E8 启动子序列,将目的基因和E8 启动子序列构建到植物表达载体pMD1 中,构建了含果实特异表达启动子的pds 基因的植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明：番茄果实特异性表达pds 的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105 中,为下一步pds 在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达

采用粟酒裂殖酵母诱导表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。通过PCR方法从绿色木霉基因组DNA中克隆到长度为1611bp并含有信号肽序列的cbhⅡ基因;将其插入到粟酒裂殖酵母诱导型表达载体pESP-2的Pnmt1启动子下游,得到重组质粒pESP-2-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞中,通过对酵母转化子质粒DNA的PCR和双酶切鉴定,得到了含有cbhⅡ基因的酵母转化子,对转化子进行诱导培养后提取酵母总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测,得到一条约为81kD的目的蛋白条带;利用DNS法对酵母转化子上清液中的纤维二糖水解酶活性进行测定,结果表明,酶活力最大值为165U/mL。以上结果证明:cbhⅡ基因在Pnmt1启动子控制下在粟酒裂殖酵母中成功地获得表达,并且cbhⅡ自身的信号肽可以被粟酒裂殖酵母正确的识别,并将表达产物分泌至胞外。     

黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)的基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增出黄杆菌HepⅡ的基因,经验证后插入到表达质粒pET-28a上构建表达载体,重组质粒转化E.coli BL21(DE3)进行蛋白质表达。结果成功地将PCR扩增得到的测序正确的HepⅡ基因构建入pET-28a载体上,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白,测活显示重组HepⅡ具有活性。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepⅡ基因。     

Bar基因双元载体的快速构建及其在蛹虫草中的功能验证

为获得草铵膦完全抑制蛹虫草生长的最小浓度和一种快速构建Bar基因双元载体的方法,本文首先采用浓度梯度法研究草铵膦对蛹虫草的抑制效果,其次采用双接头PCR(DJ-PCR)构建Bar基因表达盒,然后分别采用T4 DNA连接酶法和同源重组法把Bar基因表达盒插入双元载体pAg1-H3的T-DNA区域,以构建Bar基因双元载体pAg-Bar,并比较T4DNA连接酶法和同源重组法的连接效果,最后通过农杆菌介导转化法来验证载体pAg-Bar的有效性及Bar基因在蛹虫草中的功能。结果表明:草铵膦完全抑制蛹虫草分生孢子生长的最小质量浓度为400μg/mL;采用DJ-PCR方法可快速构建Bar基因表达盒;采用T4 DNA连接酶法和同源重组法均可实现双元载体pAg-Bar的构建,而同源重组法更快速、高效;采用农杆菌介导转化法可把双元载体pAg-Bar中的Bar基因表达盒整合入蛹虫草的基因组,使蛹虫草转化子具有草铵膦抗性。本研究建立的载体构建方法具有快速、高效的特点,适用于抗性基因载体、敲除载体、超表达载体等载体的构建,为蛹虫草基因功能的鉴定提供技术支撑。     

黑曲霉高效敲除体系构建及tpsA基因的敲除

为完善高效的黑曲霉工程菌10142基因敲除体系,提高其基因敲除效率,构建含有致死基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSVtk)的基因敲除质粒,通过农杆菌介导的黑曲霉转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)法,使致死基因随机插入黑曲霉基因组,其阳性转化子在添加10μmol/L的5-氟脱氧尿苷的培养基上无法生长,从而得到致死基因随机插入转化子的"反向筛选"方法。利用该方法对黑曲霉海藻糖-6-磷酸合成酶进行基因敲除,结果表明阳性转子占总转化子的比例为63%。成功构建高效黑曲霉基因敲除体系。