正交实验设计优化茁霉多糖发酵工艺

采用正交实验设计方法对出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)生产茁霉多糖的发酵工艺进行了优化。首先,采用单因素实验确定生产影响茁霉多糖产量的培养基组成成分和发酵条件,然后进行培养基正交实验,得到最优的培养基组合,并用此培养基进行发酵条件的正交实验,获得生产茁霉多糖最优的发酵条件。最优的培养基组成为:蔗糖100g/L、玉米浆3g/L、K2HPO42g/L和NH4NO30.4g/L,最优的发酵工艺为:初始pH6.0、装液量10%、接种量3%、种龄72h、发酵时间6d、摇床转速180r/min、发酵温度29℃。优化发酵工艺条件下茁霉多糖的产量为34.98g/L。     

碳源对出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的影响

原糖发酵生产普鲁兰多糖对于蔗糖的深加工具有重要意义。本研究考察了不同碳源底物对出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)发酵生产普鲁兰多糖的影响。结果表明,原糖发酵生产的普鲁兰多糖产量要比白砂糖、葡萄糖和淀粉高16%~53%,且多糖颜色较浅;通过正交试验优化后,发酵培养基的普鲁兰多糖产量可以达到12.39 g/L,多糖转化率可以达到26.65%。     

响应面法优化普鲁兰多糖发酵培养基

通过对出芽短梗霉生长的培养基进行优化,以提高普鲁兰多糖的产量。首先采用单因素试验筛选出有显著效应的3个因素,再利用响应面Box-Behnken设计优化显著因素的水平。结果表明：碳源(蔗糖)添加量、氮源(酵母浸膏)添加量和金属离子对粗普鲁兰多糖的产量都有显著影响(P＜0.05),蔗糖添加量和酵母浸膏添加量的交互作用相对明显,蔗糖添加量和金属离子以及酵母浸膏添加量和金属离子的交互作用不显著。优化的培养基组成为：蔗糖添加量56.63g/L、酵母浸膏添加量3.74g/L、金属离子选择Mg2+,此条件下粗普鲁兰多糖产量为60.358g/L。     

产茁霉多糖菌株的筛选和初步发酵

通过对3株产茁霉多糖菌株出芽短梗霉As3.0933,CICC40333和GIM3.44的发酵性能进行比较,选择出一株多糖产量高、多糖转化率高和产色素水平低的菌株,同时研究了培养基组分和发酵条件对该菌株发酵的影响.结果表明:As3.0933菌株的多糖产量(4.75 g/L)和多糖转化率(9.51%)为最高,色素产量居中,As3.0933可作为进一步诱变研究的出发菌株;发酵最佳碳源为蔗糖,浓度70 g/L,最佳氮源NH4NO3和酵母膏,浓度分别为0.2g/L和1 g/L.最优发酵条件为初始pH6、温度28℃、装液量30%、摇瓶转速200 r/min.在此条件下,As3.0933多糖产量为8.42 g/L(多糖转化率为12.03%).     

基于蛋白质组学分析尿嘧啶对出芽短梗霉产普鲁兰多糖的影响

为了解尿嘧啶对出芽短梗霉生长及合成普鲁兰多糖的内在机制,研究了尿嘧啶在普鲁兰多糖发酵过程中的最适添加量与最适添加时间。利用非标记（Label-free）定量技术和液相色谱-串联质谱技术比较出芽短梗霉发酵后期（88 h）的蛋白质组分,并对其差异蛋白质进行生物信息学分析。结果表明:在48 h添加0.5 g/L的尿嘧啶对普鲁兰多糖的产量提高最为显著,在5 L发酵罐上验证,产量由70.13 g/L提高到86.27 g/L,提高了23%。进行蛋白质组分分析鉴定出80个差异性蛋白质,其中包括40个上调蛋白和40个下调蛋白（差异倍数>2,P<0.05）,对这些差异蛋白进行聚类分析、GO功能富集分析、KEGG通路分析显示上述差异蛋白广泛涉及细胞过程、代谢过程等重要生物过程。差异蛋白质主要参与糖酵解、果糖和甘露糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酮酸代谢和TCA循环等代谢过程,最终引起普鲁兰多糖产量的变化。为进一步了解出芽短梗霉产普鲁兰多糖的代谢机理提供了分子基础。     

高产无色素普鲁兰糖突变菌株P1012的选育及发酵性能研究

本研究旨在选育出高产普鲁兰多糖且黑色素分泌缺失的菌株,为普鲁兰的发酵生产提供宝贵的菌种资源。研究采用三种诱变剂(紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES))对出发菌株茁芽短梗霉P23进行多轮诱变处理。通过从PDA平板上挑选出色素低且黏度大的菌落作为候选菌株,并经红外光谱(FT-IR)分析其胞外多糖的构型。结果筛选出13株候选菌株,其中菌株P1012于PDA平板上培养7 d形成的菌落为白色,96 h发酵液呈乳白色,且吸光值(OD654 nm表示色素的相对含量)达到0.048,其胞外多糖经红外光谱检测可初步分析为普鲁兰多糖,与出发菌株P23相比,菌株P1012主要表现在细胞合成色素上的缺失。发酵培养后,测得普鲁兰产量为28.01 g/L,糖转化率达到56.02%,糖转化率比出发菌株高出28.8%。表明菌株P1012可以作为生产普鲁兰多糖的候选菌株。     

Tween-60对出芽短梗霉合成多糖代谢组学的分析

利用代谢组学技术,研究了Tween-60对出芽短梗霉合成普鲁兰多糖的影响。在初始发酵培养基中添加4 g/L的Tween-60,并采用GC-MS(Gas chromatography-mass spectrometry)对实验组和空白组40 h的胞内代谢物进行分析。结果表明:普鲁兰多糖产量由78.35 g/L提高至92.5 g/L;同时确定出包括L-阿拉伯糖醇、D-核酮糖等6种代谢物表达量上调,α-D-葡萄糖、D-半乳糖等6种代谢物表达量下调。进一步分析表明,添加Tween-60可以增强胞内TCA循环以及戊糖、葡萄糖醛酸循环,为出芽短梗霉代谢提供大量能量以及胞内保护性物质。同时,发现添加Tween-60加快胞内半乳糖代谢,进而促进了普鲁兰多糖发酵前体UDPG的合成,因而多糖产量显著增高。     

普鲁兰多糖产生菌出芽短梗霉的紫外诱变及其培养基优化

为进一步提高普鲁兰多糖的产量,该文以出芽短梗霉CGMCC 3337为研究对象,通过紫外诱变获得一株性状稳定的高产普鲁兰多糖突变株UV-10,普鲁兰多糖产量稳定在（75.28±0.79）g/L,在此基础上通过单因素、响应面等试验探究高产普鲁兰多糖的最适培养基及条件。结果表明：与出发菌株相比产量提高了25.26%。通过单因素及响应面试验得到最适培养基组成：蔗糖 150 g/L,牛肉粉 4.17 g/L,MgSO4·7H2O 0.76 g/L,K2HPO48.58 g/L,FeSO4·7H2O 0.03 g/L。优化后培养基多糖产量达到97.6 g/L,与优化前相比提高了26.8%。     

响应面法优化普鲁兰多糖发酵培养基

采用响应面分析法对出芽短梗霉生产普鲁兰多糖的发酵培养基进行优化。采用Plackett-Burman实验筛选出影响普鲁兰多糖产量的主要因素为蔗糖、NaCl和FeSO4,利用最陡爬坡路径逼近响应区域,应用Box-Behnken设计和响应面分析优化得到最佳发酵培养基,发酵单位较优化前提高了30.1%。     

普鲁兰糖无色素发酵工艺研究

目的获取普鲁兰糖产量高且色素分泌少的突变菌株,优化普鲁兰糖的发酵工艺。方法紫外法诱变出芽短梗霉;通过测定普鲁兰糖的产量优化培养基组成及发酵条件。结果获得了高产普鲁兰糖且色素分泌量少的突变菌株;优化后培养基组成为:蔗糖10%,酵母膏0.2%,(NH4)2SO4 0.06%。初始pH 6.5。工艺优化后发酵过程无色素分泌,普鲁兰糖产量达到67.2 g/L。结论得到了普鲁兰糖产量高且色素分泌少的突变菌株,工艺优化后发酵过程无色素分泌。     

透析培养法稳定出芽短梗霉摇瓶发酵条件的研究

以出芽短梗霉色素低产株G58-2为生产菌株,研究了其透析培养下的菌体形态,及普鲁兰多糖摇瓶发酵的最佳条件。结果表明,通过透析培养制备的发酵接种液优于普通培养,在其OD600为0.442,接种龄36h,初始pH7.0,装液量50 mL/250 mL,摇床转速200 r/min条件下培养84 h出芽短梗霉G58-2不仅色素含量低,粗多糖产量可达到4.84 g/100 mL,并且实验稳定性有效提高。     

出芽短梗霉产黑色素发酵工艺优化

该文以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)为生产菌株,通过单因素和响应面试验对培养基组分进行优化以提高黑色素产量.结果表明,出芽短梗霉发酵产黑色素的最佳培养基组成为:蔗糖98.9 g/L、玉米浆干粉9.7 g/L、CaCl2·2H2O 2.0 g/L、NaCl 2.0 g/L、ZnSO41.0 ...     

基于遗传算法进化的人工神经网络(GA-ANN)对葡萄糖发酵生产普鲁兰多糖的条件优化

基于遗传算法进化的人工神经网络,以葡萄糖为原料,对出芽短梗霉产普鲁兰多糖的发酵培养条件进行优化。首先通过单因素试验和Plackett-Burman实验筛选显著因素,再进行Box-Behnken实验建立数据样本,最后利用Matlab建立神经网络模型寻找最优解。结果表明,葡萄糖和酵母抽提物对普鲁兰多糖的合成具有显著的正效应,K₂HPO₄对普鲁兰多糖的合成具有显著的负效应。遗传算法-人工神经网络的决定系数与相对误差分别为0.998 8与1.72%。最终优化获得普鲁兰多糖发酵的最佳培养基组分为葡萄糖150 g/L,酵母抽提物7.1 g/L,MgSO₄·7H₂O 1.4 g/L,K₂HPO₄ 7 g/L,NaCl 7 g/L,自然pH。在此条件下,普鲁兰多糖的产量为83.25 g/L,较优化前提高了79.73%。经济分析表示优化后的培养基成本较优化前降低了约70%。该研究结果为普鲁兰多糖的工业化生产提供了数据支撑,有助于提升普鲁兰多糖在行业中的竞争力。     

基于代谢组学分析MgSO4·7H2O和K2HPO4协同对普鲁兰多糖生物合成的影响

基于代谢组学技术中的气相色谱-质谱法(Gas chromatography mass spectrometry,GC-MS),研究MgSO4·7H2O和K2HPO4对出芽短梗霉产普鲁兰多糖的影响.结果 表明:在基础培养基中分别添加0.76 g/L MgSO4·7H2O或8.58 g/L K2HPO4均不能提高普鲁兰多糖...     

酵母粉对出芽短梗霉发酵普鲁兰多糖相对分子质量的影响

以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC.11062为出发菌株,研究了不同质量浓度酵母粉对普鲁兰多糖产量、结构及相对分子质量的影响。结果表明酵母粉质量浓度对出芽短梗霉的产量和相对分子质量影响显著,而普鲁兰多糖的结构基本不受其影响。在未加酵母粉时,菌体质量浓度5.92 g/L,普鲁兰多糖产量34.74 g/L,残糖质量浓度44.18 g/L,而当酵母粉质量浓度为1.5 g/L时,普鲁兰多糖的产量出现最大峰值,达到了61.32 g/L,然而,过多的酵母粉供给造成了碳源流向生物体,普鲁兰多糖产量减少。未加酵母粉时生产的普鲁兰多糖相对分子质量最大,重均相对分子质量Mw为529 528,随着酵母粉质量浓度的增加,生成的普鲁兰多糖相对分子质量逐渐降低,重均相对分子质量Mw从529 528降低到183 278,表明酵母粉可能会诱导普鲁兰多糖降解酶的产生,并导致普鲁兰多糖相对分子质量及产量的降低。这些研究为不同特性普鲁兰多糖的生产提供技术指导。     

复合诱变选育短梗霉多糖高产菌株

以本实验室保存的出芽短梗霉AP8为出发菌株,采用甲基磺酸乙酯(EMS)和紫外线(UV)复合诱变,在EMS终浓度0.4mol/L、作用时间40～60min和30W的紫外灯照射距离30cm、照射时间1.5～2.5min条件下诱变效果好,获得一株稳定遗传的多糖产量高、色素含量低的出芽短梗霉突变株UV60,产量为22.1g/L,对菌落特征和发酵特征的比较发现,突变株UV60在菌落颜色、大小、质地和发酵特性上均明显优于出发菌株AP8。通过对变异株培养基碳氮比和培养基的组成进行单因素和正交试验,其最佳摇瓶发酵培养基组成为：蔗糖50.0g/L、酵母膏1.5g/L、NaCl 1.5g/L、MgSO4 0.3g/L、K2HPO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 0.7g/L。采用上述优化的发酵培养基,突变株UV60获得的短梗霉多糖产量为27.24g/L,多糖转化率达54.48%。     

发酵生产普鲁兰多糖现状

普鲁兰多糖是由出芽短梗霉发酵所产生特殊的微生物胞外多糖,在医药、食品、轻工、化工和石油等领域具有广泛的应用。普鲁兰多糖发酵过程中,通气量、pH、温度、培养基成分（碳源、氮源、金属离子、起始离子及磷酸盐的选择）对发酵生产转化普鲁兰多糖的产量和质量均有影响。发酵转化率的进一步提高,抑制色素的生成和利用工业废物作为原料等方面是进一步研究普鲁兰多糖发酵的重点。     

出芽短梗霉聚苹果酸发酵条件的优化

在5 L发酵罐上,对出芽短梗霉PMLA发酵条件进行了研究,确定出芽短梗霉PMLA发酵的最优条件。由试验结果可知:优化的发酵温度为分阶段调节,即0~24 h设定发酵温度为30℃,24 h以后调节发酵温度为25℃;搅拌转速400 r/min;通风比1∶1.2。在此条件下,出芽短梗霉PMLA发酵获得的最大生物量为38.7 g/L;聚苹果酸产量为45.2 g/L;生产强度为0.38 g/(L·h)和PMLA分子量为8 412 Da。     

高效凝胶色谱法同时测定普鲁兰多糖生物合成过程中分子量和含量

为了建立出芽短梗霉发酵过程中同时测定普鲁兰多糖分子量和含量的高效分子排阻色谱分析方法。采用保护柱(Ultrahyfrogel~(TM)6×40 mm)和凝胶柱(Ultrahydrogel~(TM) Linear 7.8×300 mm),流动相0.1 mol/L NaNO_3,流速0.5 mL/min,柱温30℃,示差折光检测器(Waters 2424),以普鲁兰多糖分子量标准物进行分子量和含量标准曲线测定,利用建立的方法和标准曲线测定出芽短梗霉CGMCC No.11602发酵过程中普鲁兰多糖的分子量大小和含量。结果表明:普鲁兰多糖重均分子量(Molecular weight,Mw)在9.6 kDa~2 350 kDa范围内,线性关系良好(R~2=0.99),含量范围为0.2 g/L~1.0 g/L时,线性关系良好(R~2=0.99),相比于传统的方法,利用发酵液同时测定普鲁兰多糖含量和分子量与传统测定方法结果无显著性差异(p0.05)。通过新的检测方法,不仅能够实现普鲁兰多糖发酵过程中含量与分子量的实时检测,也为可控性生产不同分子量普鲁兰多糖提供技术手段。     

甘蔗糖蜜发酵合成茁霉多糖

甘蔗糖蜜为原料发酵合成茁霉多糖（Pullulan）发初始条件，本研究以生物量和多糖产量为依据，确定以甘蔗糖蜜发酵合成茁霉多糖的初始发酵培养基，该发酵培养基的组成为：经预处理后的甘蔗糖蜜发酵合成Pullulan的初始浓度100g／L至140g／L，硫酸铵不宜超过0．6g／L，硫酸镁在0．6-1．0g／L之间，而氯化钼为0.2-0.4g／L，发酵初始pH为5．5。研究结果表明甘蔗糖蜜为原料发酵合成茁霉多糖的生物合成条件是：接种量为15％，发酵温度为30℃，在充足供氧的条件下发酵时间为144h。