不同乳酸菌产谷氨酸脱羧酶特性研究

通过对发酵乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌所产谷氨酸脱羧酶(GAD)的酶学性质进行比较,分析酶反应温度、pH值、磷酸吡哆醛(PLP)浓度、酶浓度与酶活性的关系,并对高活性乳酸菌GAD酶的米氏常数进行测定。结果表明,3株乳酸菌GAD酶的最适温度为40℃,最适pH值为4.5,在PLP添加量为0.1mol/L时,对酶的促进作用达到最高,发酵乳杆菌Km值为0.05215mmol/L,最大反应速度Vmax=2.08μmol/min;短乳杆菌Km值为0.0243mmol/L,最大反应速度Vmax=1.01μmol/min。     

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

高活性果蔬谷氨酸脱羧酶的筛选及其酶学性质研究

比较芒果、荔枝、火龙果、香蕉、百香果、葡萄、猕猴桃、龙眼、黄皮果、西红柿、山竹、木瓜、苹果、菠萝等14种果蔬中的谷氨酸脱羧酶(GAD)的活力大小,并研究其中活性最高的GAD的部分酶学性质。采用高效液相法测定14种果蔬GAD粗酶液水解L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸(GABA)能力的大小,确定各种果蔬GAD的活力。通过测定高活性GAD在不同温度、p H和金属离子存在条件下的酶活以及其最适反应条件下的动力学常数研究其酶学性质。在14种果蔬中,香蕉GAD的酶活最高,达到548.03±0.08 U/g;其最适温度为45℃,在25℃~40℃具有较高的耐热性,在40℃时,GAD剩余酶活仍有80%;最适p H 5.5,在p H 3.5~5.0范围内,具有较好的稳定性;对底物谷氨酸的Km值和Vmax分别为56.2 mmol/L和9.06μg/min;在浓度为2 mmol/L时,Mg2+、Na+、Cu2+、K+对香蕉GAD活性没有明显影响,Ca2+、Al3+、Mn2+、Zn2+对香蕉GAD活性稍有抑制,SDS和Ag+对香蕉GAD有明显的抑制作用。香蕉GAD的酶活较高,具备进一步开发应用的价值。     

谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒p HY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B. subtilis/pHY300PLKgadB。研究了分别在重组菌发酵过程中添加辅酶磷酸吡哆醛(PLP)、辅酶前体吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)对GAD酶活力的影响。当设置摇床转速200 r/min,发酵温度33℃,发酵培养基初始p H 7.0时,在发酵过程中分别添加PLP、PL、PN至终浓度0.5 mmol/L,诱导48 h后发酵液中总酶活分别达到25.40、28.14、15.55 U/mL,是对照总酶活的1.55、1.72、0.95倍。基于以上结果,进一步研究了发酵过程中PL的添加浓度对重组菌生长情况及GAD表达的影响。结果表明,发酵液中GAD总酶活随着PL浓度的增加而增加,当PL浓度为0.1 mmol/L时,总酶活最高达到28.28 U/mL。利用重组菌全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA),结果表明,最适转化pH为5.0,最适转化温度为40℃,发酵过程中添加PL的重组菌(简称"GAD-PL")和发酵过程中不添加任何辅酶及辅酶前体的重组菌(简称"GAD-0")的最适加菌量(以酶活力单位计)分别是40 U/g(以谷氨酸计)和50 U/g(以谷氨酸计),当谷氨酸最终质量浓度达到400 g/L时,得到的GABA质量浓度分别为275.60 g/L和273.61 g/L。     

米糠谷氨酸脱羧酶的分离纯化及酶学性质研究

利用(NH_4)_2SO,分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱技术分离纯化米糠谷氨酸脱羧酶(GAD).米糠GAD纯化倍数为8.8,比活达到了30.1U/mg,酶活回收率为45.5%.同时对米糠GAD酶学性质进行了研究,结果表明.最适温度为40℃,耐热性较差;最适pH5.5,在pH5.5～9都可以保持较高酶活.米糠GAD对底物和辅酶PLP的K_m分别为28.45、1.13μmol/L.KI、Ag~+、SDS、乙酸对米糠GAD的活力有较大的抑制作用,而Ca~(2+)对米糠GAD的活性有较强的激活作用.     

植物乳杆菌漆酶的酶学性质及其对生物胺的降解作用

为研究乳酸菌来源的漆酶酶学性质及其在生物胺降解中的应用潜力,以来源于植物乳杆菌的漆酶编码基因为研究对象,对其进行异源表达及酶学性质的研究,测定其最适温度和pH值、金属离子及螯合剂对漆酶活性的影响、重组漆酶对不同体积分数的乙醇的耐受性以及重组酶对生物胺的降解作用。结果表明,重组漆酶最适温度为40℃,最适pH值为4.0;低浓度的Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺对重组漆酶活力具有不同程度的促进作用,其中Zn²⁺和Ca²⁺的促进作用最为明显;反之,高浓度的Mn²⁺、Fe²⁺和乙二胺四乙酸能够抑制重组漆酶活力至原本的15%甚至更低;2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为底物时重组酶的米氏常数为2.49 mmol/L,最大反应速率为0.22 mmol/(L·min);重组漆酶对低体积分数乙醇具有很好的耐受性,在含有20%乙醇的体系中保存1 h后相对酶活力仍可达75%以上。生物胺降解实验表明,重组漆酶对酪胺和色胺的降解率达到了100%,对亚...     

超声波条件下蒜氨酸酶性质研究

对新鲜大蒜中的蒜氨酸酶进行分离、纯化,研究超声波条件下已纯化的蒜氨酸酶的酶学性质。研究结果表明,最佳超声波作用条件为频率135 kHz、功率110 W。在该条件下,蒜氨酸酶的最适温度35℃,最适pH 6.5,在20～40℃温度范围酶活性较稳定;Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+对蒜氨酸酶的活性有激活作用,K+、Mg2+、Cu2+抑制酶的活性;0.025 mmol/L外源PLP和0.5 mmol/L L-半胱氨酸对蒜氨酸酶的活性有促进作用。     

米糠谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

研究了米糠谷氨酸脱羧酶(GAD)的酶学性质。结果表明:米糠GAD的最适温度为40℃,最适pH5.6,米糠GAD耐热性较差,60℃下保温0.5 h后,酶活下降至65%,保温1 h,酶活下降至48%,而70℃时酶就完全失活,而此酶在pH5.5～9都可以保持84%以上的酶活力。米糠GAD对底物和辅酶PLP的Km分别为0.028 45 mol/L和1.13μmol/L。KI、Ag~(2+)、SDS、乙酸对米糠GAD的活力有较大的抑制作用,而Ca~(2+)对米糠GAD的活性有较强的激活作用,提高了底物与米糠GAD的亲和力。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

玉米胚谷氨酸脱羧酶的性质

研究了玉米胚谷氨酸脱羧酶(GAD)的性质。结果表明:玉米胚GAD的最适温度为40℃,最适pH为5.7,其热稳定较差,60℃下保温1 h,酶活下降至39%,85℃时酶完全失活,而此酶在pH4.5～7.5可保持80%以上的酶活。玉米胚GAD对Glu的Km值和Vmax分别为51.87 mmol/L和1.807 mg/min。另外,KCl、NaCl和SDS对玉米胚GAD活性有较大的抑制作用,而Ca2+对此酶的活性有较强的激活作用,可提高底物与玉米胚GAD的亲和力。     

基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-pel重组果胶酶的纯化及酶学性质

采用超声波破碎法、镍离子亲合层析柱法,纯化重组菌Escherichia coli BL21/pET-pel表达的胞内重组果胶酶,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide pelelectrophoresis,SDSPAGE）检测,研究纯化的重组果胶酶酶学性质。结果表明：重组果胶酶纯化倍数为1.71,回收率为88.5%,分子质量约为44 kD。最适pH值为9.0～9.5,在pH 7.0～10.0之间催化性质较稳定;最适作用温度范围为45～55 ℃,在60 ℃下保温30 min还剩余40%的酶活力;在离子浓度为1 mmol/L时,Ca2+和Co2+对该酶有较强的促进作用,而Fe2+则对其有较强的抑制作用。     

紫色红曲霉FBKL3.0018产酯化酶的酶学性质研究

以从紫色红曲霉FBKL3.0018中固态发酵得到的粗酶制剂为研究对象,对该菌株的酯化酶酶学性质进行了较系统的研究。通过单因素实验确定该酶最适温度为40 ℃,在30 ℃条件下稳定性较好,最适pH值为6.5,在pH5.5～7.5条件下稳定性好。Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+对酯化酶酶活力有抑制作用,Ca2+在低浓度时有促进作用,高浓度时有抑制作用。K+对酯化酶酶活力有促进作用,并且随着K+浓度的升高,促进作用逐渐增强。吐温-80、十二烷基硫酸钠（SDS）、聚乙二醇6000、阿拉伯胶4种表面活性剂对酯化酶酶活力都有抑制作用。另外,甲醇和乙醇对该酯化酶酶活力有抑制作用,甲酸、乙酸、乳酸对酯化酶酶活力有促进作用。乙酸乙酯在低浓度时对酯化酶酶活力有抑制作用,含量为30%时反而有促进酶活力的作用。酯化酶最大反应速度Vmax为0.016 mol/（L·min）,米氏常数Km为0.015 4 mol/L。     

产谷氨酸脱羧酶片球菌的鉴定及其酶学性质

从发酵蔬菜中分离一株产谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)的乳酸菌HS2,其菌体细胞转化Glu 1h,转化液中γ- 氨基丁酸含量可达(3.114 ± 0.133)g/L,通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育分析,鉴定菌株HS2 是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。菌株HS2 GAD 最适作用温度为35℃,最适作用pH4.5。酶的热稳定较好,在pH4.0～6.5 于50℃处理4h,酶活基本稳定。Ca2+ 对酶有激活作用,5mmol/L 和50mmol/L Ca2+ 浓度使酶活分别提高了37.21% 和23.02%。Mg2+ 和Mn2+ 在50mmol/L 浓度时激活作用明显,而Co2+在5mmol/L 浓度激活作用较好。     

重组大肠杆菌耐热α - 淀粉酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组大肠杆菌耐热α- 淀粉酶分离纯化及其酶学性质进行研究,结果表明：该酶分子量约为90kD,最适温度为60～70℃,最适pH 值为6.6,酶学动力学常数Km 值为143.52mmol/L;酶活力在pH5.4～7.8 较为稳定;4℃保存2 周酶活力仅下降一半,35℃保温3d 有50% 以上的酶活力,70℃以上酶失活很快;Mn2+ 对酶催化作用有较大的促进,K+、Ca2+ 有微弱的促进作用,Mg2+ 对催化反应无影响,Cu2+ 的抑制作用最强,其他金属离子Co2+、Zn2+、Fe2+ 对酶催化作用有不同程度的抑制作用;有机离子对酶催化作用均是抑制作用,其中抑制作用最强的是SDS。     

磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究

研究重组磷脂酰丝氨酸合成酶表达条件及其用于酶法合成磷脂酰丝氨酸的反应条件。结果表明,在50 mL培养基中,菌体浓度为OD600=0.6时,用0.5 mmol/L的IPTG,在温度为20℃,转速为120 r/min的条件下,诱导12 h后,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力可达1.33 U/mL,是优化前的1.66倍。酶法转化磷脂酰丝氨酸的最适温度为38℃,最适pH为8.0,最适离子是12 mmol/L Mn2+,最适表面活性剂是1.0%Trition X-100。在最适条件下,磷脂酰丝氨酸转化率可达33.15%。     

低温β-半乳糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

对来自新疆天山冻土的Rahnella sp.R3所产的胞内低温β-半乳糖苷酶进行纯化,并对其酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Q Sepharose High Performance阴离子交换层析、Sephacryl S-200High Resolution凝胶过滤层析,得到电泳纯酶。酶的活性回收率为21.3%,纯化倍数为35.6,比酶活由1.28U/mg提高到45.54U/mg。SDS-PAGE电泳显示其表观分子量为57.3kDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,在15℃时的酶活为最高酶活的40%,4℃时的酶活为最高酶活的23%。该酶对热敏感,45℃保温45min酶活全部丧失。纯酶的最适pH为7.0,在pH 6.5~7.5时保持稳定。5 mmol/L Na+、Ca2+、Cu2+、Al 3+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,其中Al 3+抑制作用最强,Na+、Ca2+抑制作用不明显。5 mmol/L Mg2+、K+对酶活力具有促进作用,其中Mg2+促进作用较强,使酶活提高到1.19倍。25℃以ONPG为底物的Vmax,Km值分别为7.19mol/(min·mL)、4.64mmol/L。     

根霉ZM-10脂肪酶部分纯化及酶学性质研究

本实验室以合成己酸乙酯的转化率为指标,从酒厂筛选到一株合成己酸乙酯活性较高的根霉ZM-10,本实验以该菌株为出发菌种,将其脂肪酶进行部分纯化后,研究了酶学性质.结果表明,根霉脂肪酶的最适反应温度为25℃;在20℃时具有较好的稳定性,该酶在30℃80min后,残活还有31.9%;脂肪酶在pH7.0和8.0有较好的稳定性:2mmol/L金属盐离子浓度时,Na 、Cu2 、Fe3 、EDTA对脂肪酶的活力有一定的促进作用,在5mmol/L时,除Cu2 外,其他金属离子均表现出不同程度的抑制作用;表面活性剂CTAB和Tween-80对脂肪酶活性有一定的抑制作用,SDS改善作用比较大;在最适反应条件下的动力学常数Km和Vmax分别为18.2mmol/L和625U/L.     

山楂多酚氧化酶的酶学特性研究

研究山楂多酚氧化酶(PPO)的酶学特性。采用分光光度法测定PPO的酶活性,考察底物特异性、p H值、温度、热稳定性、底物浓度、金属离子以及抑制剂对PPO酶活性的影响。实验结果表明,山楂PPO的最适底物为邻苯二酚;最适p H值为6.5;最适温度为40℃;90℃热处理1.0 min或85℃处理1.5 min PPO酶活基本完全丧失;山楂PPO最适底物浓度为0.10 mol/L,PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程,相应的动力学参数Km=55.83 mmol/L,Vmax=98.04 U/min;Al3+对PPO酶活的抑制作用较强,Mn2+、Ca2+和Zn2+次之,Cu2+和Mg2+对PPO酶活抑制作用不明显,Fe3+对PPO酶活有一定的促进作用;四种抑制剂对山楂PPO酶活均有一定的抑制作用,且抑制效果与抑制剂浓度呈量效关系,相同浓度下抑制效果由强到弱顺序为:抗坏血酸L-半胱氨酸亚硫酸氢钠柠檬酸,抗坏血酸的抑制效果最为显著。     

粪肠球菌SK32.001精氨酸脱亚胺酶的分离纯化及酶学性质研究

对Enterococcus faecalis SK32.001所产的精氨酸脱亚胺酶(ADI)进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。实验结果表明,通过细胞破碎,硫酸铵沉淀,Hi Prep Q FF 16/10阴离子交换层析,Sephadex G-75等纯化方法获得电泳纯精氨酸脱亚胺酶,分子量约为42ku,催化最适温度和p H分别为50℃和6.5,在30~40℃和p H5.5~7.5时较稳定。不同浓度的Zn2+对酶活性影响较大。1mmol/L的Zn2+和10mmol/L的Co2+、Ca2+、Mg2+对酶活有较大的促进作用,10mmol/L的Cu2+对酶的抑制作用最强。精氨酸脱亚胺酶在最适反应条件测定其米氏常数为1.33mmol/L,最大反应速度为2.41μmol/min。     

屎肠球菌源谷氨酸脱羧酶的制备及其酶学性质研究

为了开发谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD),以Enterococcus faecium为gadB基因供体、纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)为亲和标签,利用内含肽DnaB自剪切作用分离GAD,对融合酶CBD-DnaB-GAD的构建、表达、GAD纯化及其酶学性质进行了探讨。结果表明:重组Escherichia coli GDMCC60446可高效表达CBD-DnaB-GAD,适宜自剪切液为0.2 mol/L Na₂HPO₄-NaH 2PO₄缓冲液(pH 6.5,含NaCl 0.5 mol/L、EDTA 1 mmol/L);经一步纯化和自剪切制备的GAD在SDS-PAGE电泳上呈单一条带,分子质量约为55.68 kDa,仅有1个亚基;GAD最适反应pH和温度分别为5.0和55℃,在pH 4.8~5.8和-25~55℃较稳定;5 mmol/L的NaCl、CaCl₂和乙二醇对GAD酶活力影响不大,而KCl、EDTA-2Na、ZnSO₄、CuSO₄、MnSO₄、MgSO₄、FeCl₂、FeCl₃、AlCl₃、AgNO 3和Pb(CH₃COO)₂对GAD酶活力具有不同程度的抑制作用;GAD仅催化L-谷氨酸发生脱羧反应,K m和V max分别为10.51 mmol/L和3.41μmol/(mL·min),催化反应无底物和产物抑制作用。GAD纯度和酶学性质优良,制备工艺简便,该技术有望应用于工业化生产。