免疫磁球捕获-PCR检测牛奶中金黄色葡萄球菌的研究

对免疫磁球捕获-PCR(IMS-PCR)检测牛奶中金黄色葡萄球菌进行了初步研究。优化了免疫磁球制备参数,确定了金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的结合时间。研究结果显示,当纯菌浓度为101~104CFU/m L水平时,金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的捕获率大于80%。通过对目标菌和非目标菌的检测,IMS-PCR检测方法显示了很强的特异性;在纯培养、无需增菌情况,IMS-PCR检测方法检测限为104CFU/m L;牛奶中的金黄色葡萄球菌经磁分离后增菌2h用PCR检测,可检测出104CFU/m L的金黄色葡萄球菌。     

速冻面米制品中金黄色葡萄球菌和肠毒素A基因三重PMA-qPCR快检方法的建立

为建立准确定量速冻面米制品中金黄色葡萄球菌活菌,筛查肠毒素sea基因并指示PCR反应假阴性的三重PMA-qPCR检测方法。针对金黄色葡萄球菌特异靶基因RpiR和肠毒素基因sea序列保守区,设计引物、探针和构建扩增内标,优化建立三重qPCR检测体系,建立PMA食品前处理方法去除死菌DNA,构建纯培养物和速冻面米制品中污染金黄色葡萄球菌的定量标准曲线,应用三重PMA-qPCR方法检测人工污染金黄色葡萄球菌的速冻面米制品。采用GB4789.10-2016中规定的选择平板计数法,评价三重PMA-qPCR方法的检测性能。结果表明,三重PMA-qPCR检测体系扩增效率高,特异性好。当食品中金黄色葡萄球菌污染量大于10~3CFU/g时,靶基因RpiR可获得有效扩增,污染量在10~3～10~7CFU/g之间时,扩增曲线线性良好(R~2=0.994),PMA-qPCR定量结果与平板计数结果一致性较好。当sea阳性菌株污染量大于10~3CFU/g时,应用PMA-qPCR方法可有效评估食品污染肠毒素A的风险。综上所述,本研究建立的三重PMA-qPCR检测方法操作简便,可快速定量检测速冻面米制品中金黄色葡萄球菌,评估食品污染肠毒素A的风险。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了对肉中金黄色葡萄球菌检测的方法。实验中,使用了最新的Bst 2.0 Warm Start DNA聚合酶完成LAMP扩增反应,并针对金黄色葡萄球菌所特有的保守性耐热核酸酶基因（nuc）设计得到了一套LAMP扩增引物。对LAMP法和PCR法的检测灵敏度进行了比较,同时对人工污染肉中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明：所建立的LAMP法能够特异性的检测金黄色葡萄球菌,并且检测金黄色葡萄球菌纯菌的灵敏度为2.01×10~0CFU/m L,是普通PCR检测灵敏度的100倍。在检测肉中金黄色葡萄球菌时,检测限为2.01×10~1CFU/m L。因此,本实验所建立的LAMP法检测肉中金黄色葡萄球菌的方法,具有灵敏、快速以及简便等的优点,是一种具有很好的发展前景的检测手段。     

实时荧光单引物等温扩增技术检测牛乳中的金黄色葡萄球菌

研究建立了一种实时荧光单引物等温扩增(RF-SPIA)技术以检测牛乳中的金黄色葡萄球菌。针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因设计引物,对金黄色葡萄球菌进行特异性检测。结果表明,6株金黄色葡萄球菌的检测结果为阳性,而其他17株非金黄色葡萄球菌的检测结果均为阴性。RF-SPIA检测金黄色葡萄球菌纯培养物的灵敏度为2.0×101 CFU/m L,检测人工污染牛乳的检出限为6.0×101 CFU/m L。该方法特异性强、灵敏度高,能够实现对金黄色葡萄球菌的实时、快速检测,为金黄色葡萄球菌的检测提供了一条新途径。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测食品中金黄色葡萄球菌的方法评价

目的 以传统国标培养法作为参比方法, 评价实时荧光核酸恒温扩增检测(real-time simultaneous amplification and testing, SAT)方法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力。方法 依据 GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对SAT法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力进行评价。分别检测纯培养物、人工污染样品以及实际样品来评价试剂盒的灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率和准确度, 同时采取2种方法的显著性差异分析, 确定最终结果。结果 SAT法灵敏度为100, 纯培养物检出限为103 CFU/mL, 人工污染检出限灵敏度为103 CFU/mL, 假阴性率为0、假阳性率为2.9%; 金黄色葡萄球菌的特异性符合要求。结论 SAT检测方法灵敏度高、特异性好, 假阳性率、假阴性率、准确度等检测结果全部达标, 并且检测时间短, 适用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。     

牛奶中志贺氏菌PCR检测方法的建立

根据Genbank志贺氏菌侵袭性质粒抗原H (ipaH)基因序列, 自行设计引物, 扩增特异的326 bp核酸片段, 经过优化PCR扩增条件, 建立了志贺氏菌特异、敏感、快速的PCR检测方法, 并对牛奶中的志贺氏菌进行了检测.特异性试验结果表明, 志贺氏菌参考菌株均能扩增出特异的核酸片段, 大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明, 采用试剂盒提取基因组, 该方法的敏感性可达到1.75×102 cfu/mL.人工污染牛奶的模拟检测结果表明, PCR方法的检测限为1.75×103 cfu/mL.     

三重荧光PCR检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种检验沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7的Taqman探针三重荧光PCR方法。方法 针对沙门氏菌属特异性invA基因、金黄色葡萄球菌rpoB基因、大肠埃希氏菌O157：H7 的rfbE基因设计引物与探针,建立三重荧光PCR体系,对引物与探针浓度及退火温度优化,并进行特异性和敏感性研究。结果 引物与探针的最优浓度组合为：invA 0.2μL、ropB 0.4μL、rfbE 0.5μL;最优退火温度为60℃。16株非目标菌株扩增结果为阴性;目标菌株均出现显著扩增。敏感性试验显示,三种微生物对应的能检出的最低菌体数量依次为：460CFU、76CFU、660CFU。结论 该方法特异性好、灵敏度高,能够快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7     

量子点免疫标记法同时检测2种食源性致病菌

目的:建立快速检测金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌的量子点免疫标记方法。方法:利用免疫磁珠富集,量子点标记,微型光纤光谱仪对金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌进行定量检测,建立荧光强度与菌浓度的定量模型,并对捕获条件进行优化。结果:两种目标菌的最佳捕获条件为免疫捕获时间45 min、磁分离时间1.5 min、PBS浓度0.01 mol/L。目标菌浓度在10~2~10~5 CFU/m L范围,目标菌与荧光强度的线性关系为:金葡菌FI=9.2744lg N+50.14,福氏志贺氏菌FI=18.616lg N+53.784,N为目标菌细菌菌落数,CFU/m L;FI为荧光强度值。金黄色葡萄球菌决定系数R~2=0.9626,福氏志贺氏菌决定系数R~2=0.9778,说明具有很好的拟合性。重复性测试结果中相对标准偏差为2.9%,检测时间在2 h内。结论:本文建立的检测方法简单,快速,灵敏度高,特异性好,具有很好的应用前景。     

多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌

目的建立多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3种常见致病菌的方法。方法筛选目标菌株的特异性引物与探针,优化反应体系,建立稳定的多重q PCR反应体系。通过阳性菌株加标的方式验证体系的特异性,并确定人工污染奶粉的检出限。结果各对引物探针对目标菌株均能扩增,多重实时荧光PCR未发现交叉反应,对17株非目标菌进行检测均未检出,人工污染奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的检出限均为10~3 CFU/mL,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/mL。结论本研究方法可实现婴幼儿奶粉样品中3种致病菌qPCR高效率检测。     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

PMA-LAMP方法检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌的研究

近年来,金黄色葡萄球菌引起的食品安全事件频发,这就需要建立一种快速准确地检测食品中金黄色葡萄球菌的方法。传统方法检测食品中金黄色葡萄球菌活菌存在很多缺点。由于细胞死亡后其DNA依然能够存活许久,所以传统方法不能有效区分DNA来自死菌还是活菌。通过荧光染料PMA与快速检测技术LAMP相结合的方法快速、灵敏的检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌,并对死/活菌进行区分。根据金黄色葡萄球菌nuc基因设计引物,并对LAMP反应体系及PMA-LAMP方法进行优化,同时优化了灭菌乳中提取DNA的方法。在纯培养的金黄色葡萄球菌中,PMA-LAMP方法检测灵敏度为3.2CFU/mL,PMA-PCR方法的检测灵敏度为3.2×102CFU/mL;对人工污染灭菌乳中的金黄色葡萄球,PMA-LAMP方法检测灵敏度为5×101CFU/mL,而PMA-PCR方法检测灵敏度为5×103CFU/mL。整个反应需要大约6h,说明PMA-LAMP方法检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌活菌的新方法。     

速冻食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与应用

为实现速冻食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多重聚合酶链式反应(PCR)检测,首先优化多重PCR扩增的反应条件,比较基因组DNA提取方法,结果表明：退火温度采用60℃、各引物浓度200nmol/L及扩增循环35次,本多重PCR检测技术可以有效地将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检出,检测特异性为100%。3种DNA提取方法中试剂盒法纯度最高,检出限分别是31、26DNA copies/reaction。经过在人工污染致病菌的速冻水饺中应用试验后,该多重PCR方法经过4h的增菌培养即可从速冻水饺中同时检测出起始菌落数低至100CFU/g的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌

通过建立的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法以达到肉中单增李斯特菌快速、灵敏的检出。以特异性的hly A毒力基因作为靶基因,与6株非单增李斯特菌进行特异性试验,同时对不同培养浓度的单增李斯特菌进行了LAMP和PCR方法的灵敏度比较,进而应用LAMP法检测人工污染肉中的单增李斯特菌。结果表明:纯培养物中单增李斯特菌LAMP检出限为8.8×10~0CFU/m L,其灵敏度比普通PCR高100倍;在人工污染肉中单增李斯特菌的检出限为8.8×10~1CFU/m L,在1h内即可完成扩增反应。LAMP方法具备快速、特异、简单、灵敏度高等优势,在食品基质中单增李斯特菌的检测方面具有较好的应用前景。     

牛奶中3种致病菌多重PCR的建立及初步应用

为了能同时在牛奶中快速检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌,本研究根据GenBank中的金黄色葡萄球菌femB、大肠杆菌phoA、沙门氏菌invA基因序列,分别设计3对特异性引物(目的片段分别为233 bp、444 bp、724 bp),通过对PCR反应条件的优化建立了多重PCR方法。敏感性、特异性试验结果显示,该多重PCR对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的最低核酸检测量分别为13.3 pg/mL、13.3 pg/mL、133.3 pg/mL,而对牛结核杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌的扩增结果均为阴性。对25分临床样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的快速鉴别诊断。     

PMA与ddPCR结合检测单核细胞增生李斯特氏菌

将叠氮溴化丙锭(PMA)与微滴数字PCR(dd PCR)技术相结合,检测热灭活背景下单核细胞增生李斯特氏菌活菌。结果表明,PMA终浓度为5.0μg/m L、曝光时间为15 min时,可以有效抑制10~5 CFU/m L的单核细胞增生李斯特氏菌死菌DNA的PCR扩增,不抑制单核细胞增生李斯特氏菌活菌DNA扩增的PMA最高浓度是10.0μg/m L。利用PMA处理死活菌混合液时,PMA-dd PCR可以在死菌存在的条件下,定量检测活菌,降低了"假阳性"结果的出现。检测结果显示:PMA-dd PCR灵敏度是2.0 copy/20μL。利用PMA-dd PCR检测人工污染的鳕鱼样品,最低可检出10~2 CFU/m L的单核细胞增生李斯特氏菌。结果证明PMA-dd PCR方法的精确度、稳定性良好。     

食品中荧光假单胞菌双重PCR法检测体系的建立和评价

根据荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)促旋酶(gyrase)的B亚单位基因以及金属蛋白酶(apr)基因设计出两对引物,经过反应条件的优化,建立了用于荧光假单胞菌快速检测的双重聚合酶链式反应(PCR)方法,并对该体系进行评价。结果显示,Pseudomonas fluorescens菌株经普通PCR扩增均可见2条特异性条带(384 bp和194 bp),而其它阴性对照菌株PCR扩增均为阴性。基于基因组DNA的双重PCR检测灵敏度为16.9 fg/μL(3~4拷贝/μL),1.8CFU/m L的UHT牛奶样品(250 m L)经增菌24 h后用该双重PCR方法均可检出。本研究建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度,能克服乳制品样品基质的干扰,可应用于乳制品中荧光假单胞菌的快速检测。     

TaqMan探针荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D

建立了检测乳中产肠毒素D的金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法,以SED基因为肠毒素D的检测靶序列,设计荧光定量PCR引物和Taq Man探针,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了对产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速检测的Taq Man探针荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,Taq Man探针实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D的方法具有极强的特异性,标准曲线的相关系数为0.999,最低可检测到40copies/m L的阳性质粒,检测乳中产肠毒素D金黄色葡萄球菌的灵敏度为1.0×102CFU/m L。该检测方法具有较好的特异性和灵敏性,在产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速筛查方面具有良好的应用前景。     

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg2+浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在102 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到103 CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。