低温肉制品中3种食源性致病菌多重聚合酶链式反应快速检测方法的建立

针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有害微生物,利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,m-PCR)的方法,对3种菌同时快速检测,从而达到节省时间,提高效率的目的。使用沙门氏菌的inv A基因、金黄色葡萄球菌的Prf A基因和单增李斯特菌nuc基因设计3对特异性引物,在确定特异性引物的基础上,将3种菌进行培养增菌后接种于低温肉制品中,过夜富集后收集并进行灵敏度检测,优化多重PCR反应体系并应用于实际样品的检测。结果表明:多重PCR方法在同时检测这3种有害微生物时,m-PCR最佳反应条件如下:25 μL反应体系、10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL及上、下游引物各0.5 μL、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙门氏菌的模板2.0 μL,加dd H_2O补足至25 μL,最佳退火温度为64℃。多重PCR快速检测方法适用于低温肉制品中沙门氏菌等3种食源性致病菌的检测,具有快速、灵敏、特异、简便等特点。     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

摘要：目的 建立多重荧光定量聚合酶链反应法（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌的方法。方法 根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果 该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为101、102、102拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE（Salmonella、Listeria monocytogenes and Escherichia coli 3种菌株的共增菌培养基）培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×102 CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×102 CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×102 CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论 所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。     

多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

单增李斯特菌毒力因子多重荧光PCR法 建立与应用

目的建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)及其3种毒力因子的多重荧光PCR快速检测方法,并应用于日常食品的检测。方法根据单增李斯特菌溶血素基因hly A、内化素基因inl A和表面蛋白act A基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和探针,优化多重荧光PCR反应体系。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果该法特异性强、敏感性高,对单增李斯特菌纯培养物的最低检出限410cfu/m L;重复性好,变异系数均小于2%。对84份食品检测结果与传统国标法相符,共检出单增李斯特菌4份,检出率为4.76%。多重荧光PCR检测方法耗时1 h,比传统方法节约2~5 d。4株单增李斯特菌分离株中2株同时含有inl A、act A、hly A 3种毒力基因,另2株为毒力基因act A缺失株,提示目前流行株并非同一来源。结论本研究建立的多重实时荧光PCR方法能同时对单增李斯特菌及其3种毒力因子进行快速检测,且灵敏度高、特异性好,为食源性疾病的病原学检测提供了快速可靠的方法。     

聚合酶链式反应技术快速检测原料乳中荧光假单胞菌

目的 利用PCR（polymerase chain reaction）技术建立一种快速、准确检测原料乳中最常见有害嗜冷微生物——荧光假单胞菌的方法。方法 以荧光假单胞菌蛋白酶基因aprX为检测靶标,设计特异性PCR简并引物,建立原料乳中荧光假单胞菌PCR检测体系,对该体系的特异性及检测限进行评价。结果 筛选到特异性引物F3：5’-WSNGGNGGNGAYTTYCAYATGAC-3’;R3：5’-RTCRTTNCCNCCNCCRTCCC-3’,建立了最佳PCR检测体系：引物浓度0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶添加量0.4 μL、dNTPs浓度0.16 mmol/L、Mg²⁺浓度1.6 mmol/L,退火温度56.4 ℃,扩增35个循环。此检测方法对荧光假单胞菌具有特异性,检测限为2.57×10³ CFU/mL。结论 本方法操作简便,特异性强,检测限低,对快速检测原料乳中嗜冷菌,保障原料乳品质与安全具有一定参考意义。     

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌

建立一种运用多重聚合酶链式反应(PCR)结合基因芯片技术检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的快速、准确、灵敏的方法。分别选取编码大肠埃希氏菌的slt基因、沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因和单核细胞增生李斯特菌inlA基因,并以细菌16S rDNA基因作为阳性对照,设计引物和探针,进行多重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。结果表明：该基因芯片可同时特异性地检测5种致病菌,多重PCR检测灵敏度为20pg,而DNA芯片检测灵敏度可达2pg;用所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品,准确率高于传统培养法。所建立的基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高,可为食源性致病菌的检测提供理想手段。     

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌

目的 建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测方法。方法 针对选择铜绿假单胞菌gyrB基因设计特异性引物和探针。250mL水样经膜过滤后经过短时培养(36℃、4 h),优化提取菌体DNA流程,预冻干聚合酶链式反应预混液,采用实时荧光聚合酶链式反应进行检测。结果 样品中铜绿假单胞菌量为≥1 CFU/250 mL时,检测结果均呈阳性,整个检测用时6 h左右。该方法检测结果与国家标准方法(GB8538—2022)检测结果一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高、用时短,可为预包装饮用水中铜绿假单胞菌监管和生产企业质控提供更为快速、精准的技术手段。     

肉中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法建立

目的:建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法:采用聚合酶链式反应技术(PCR)特异性扩增单核细胞增生李斯特菌内化素基因(ivlA),并评价该方法的特异性与敏感性。结果:在445bp处出现inlA基因的目的片断,只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性;该方法可以检测到DNA的检测限。结论:PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便;为肉中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

实时荧光HDA法快速检测单核细胞增生李斯特菌

目的：建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增（helicase-dependentisothermal DNA amplification,HDA）快速检测方法。方法：针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）仪的平台,提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA,以此作为模板,优化反应温度、反应时间及引物浓度。利用单核细胞增生李斯特菌及10 株对照菌株,并与实时荧光PCR对比,来验证实时荧光HDA方法的特异性和灵敏度,并初步用于样品检测。结果：实时荧光HDA体系的最适引物浓度为0.075 μmol/L,反应温度及反应时间为65 ℃、80 min（40 个循环）,具有良好的特异性和灵敏度。结论：建立了一种特异性强、灵敏度高的实时荧光HDA检测单核细胞增生李斯特菌的方法。     

Multiplex PCR for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in meat samples

A multiplex PCR method was developed for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in meat samples. DNA detection sensitivity for this method was 10(3) CFU/ml for each pathogen. When this protocol was used for the detection of each of the above pathogenic bacteria in spiked pork samples, 1 cell per 25 g of inoculated sample could be detected within 30 h. In the samples of naturally contaminated meat, Salmonella spp., L. monocytogenes, and E. coli O157:H7 were detected over the same time period. Excellent agreement was obtained for the results of multiplex PCR and the conventional culture method, which suggests that the multiplex PCR is a reliable and useful method for rapid screening of meat products for Salmonella spp., L. monocytogenes, and E. coli O157:H7 contamination.     

Investigation of the effectiveness of Ascopyrone P as a food preservative

Ascopyrone P (APP), a novel antibacterial from fungi, was evaluated as a food preservative. Efficacy was generally assessed by comparing the time taken for test strains to grow to 10(6) CFU/g in food +/- APP. In chilled chicken soup, 2000 mg kg-1 APP prevented Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens, Salmonella and Escherichia coli reaching this threshold for >60 days. Good activity was also observed at 500-1000 mg kg-1 but not against L. monocytogenes. No activity was observed against Saccharomyces cerevisiae. Activity was reduced at 20 degrees C, although 2000 mg kg-1 was still effective against B. cereus and P. fluorescens. APP was less effective in chilled cooked meat systems and ineffective in raw meat. In a cooked meat system at 8 degrees C, bacteriostatic effect was generally observed at 2000 mg kg-1 against Salmonella typhimurium, E. coli and P. fluorescens but not against L. monocytogenes or Lactobacillus sake. Activity against Gram-negative enteric bacteria was enhanced by low temperature. In milk, 2000 mg l-1 was effective against P. fluorescens at chilled but not ambient temperature. APP was ineffective against yeasts and the mould Byssochlamys in apple juice. A minimum of 2000 mg kg-1 APP would appear to be necessary for antibacterial efficacy in food, although low-temperature storage may help. Observed variations in sensitivity may be related to APP stability, which decreases >pH 5.5. Toxicology testing is needed before consideration of APP for food use.     

酱卤肉中沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌生长特性及预测模型建立

依据流行病学的调查结果,酱卤肉中检出率较高的致病菌为沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。本实验对该两种代表性致病菌以酱卤肉作为培养基成分在不同温度下的生长特性进行研究,建立了不同温度下沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的生长一级模型和二级模型。在沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌培养温度范围内得出酱卤肉制品中沙门氏菌的动力学模型为：lgN＝A＋（10.2－A）×exp{－exp[e×（－3.173 1T2＋2.02T＋1.812）×（1.252T2－7.746T＋1.22－t）/（10.2－A）＋1]};酱卤肉中单核细胞增生李斯特菌的动力学模型为：lgN＝A＋（17.9－A）×exp{－exp[e×（－9.024T2＋5.774T－4.402）×（1.378T2－7.995T＋1.172－t）/（17.9－A）＋1]}。运用该预测模型可描述自然状态下酱卤肉制品中的两种代表性致病菌数量的动态变化,为该类产品的生产、运输、贮藏及销售过程中的食品安全保证提供良好的理论依据,用以减少由致病菌引发的食品安全风险,并为建立酱卤肉企业的食品安全管理体系提供科学基础。     

市售生鲜鸡肉5 种主要食源性致病菌污染检测及分布概率评估

采用聚合酶链式反应技术对上海市52 个市场的208 份鸡腿、鸡爪、鸡翅、鸡胗、鸡胸肉中出血性大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌5 种食源性致病菌进行快速检测,以了解不同鸡肉食用部位各种致病菌的分布规律,并根据β概率分布确立最具代表性的部位作为评估靶点。结果显示：在208 份样品中,大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌未检出;阪崎肠杆菌在鸡翅中检出1 株;志贺氏菌检出2 株,分布于鸡翅、鸡胗;单增李斯特菌检出11 株,检出率达5.29%,且在鸡翅中检出率最高（4 株）,鸡腿（3 株）、鸡爪（3 株）部位检出率相当,鸡胗检出率最低（1 株）。     

Enrichment and DNA extraction protocols for the simultaneous detection of Salmonella and Listeria monocytogenes in raw sausage meat with multiplex real-time PCR

A novel method of DNA extraction and purification was developed and was used in conjunction with a multiplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of Salmonella and Listeria monocytogenes in a raw meat sample. The PCR used primers targeting the invA gene of Salmonella and the hlyA gene of L. monocytogenes, and PCR products were detected with a LightCycler on the basis of fluorescence from SYBR Green and melting temperature. The assay allowed the detection of 3 Listeria cells and 4 Salmonella cells per g of the original sausage within 10 h, including an enrichment period of 6 to 8 h.     

2010年山西省食品中食源性致病菌监测分析

目的 了解山西省食源性致病菌的污染现状.方法 按照2010年度《全国食源性致病菌监测工作手册》进行.结果 1 576份样品中共检出阳性菌株149株,检出率为9.45％,其中单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌污染比较严重,总检出率为9.50％和8.22％,金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌和沙门氏菌的总检出率分别为3.02％、1.11％和0.87％.不同类别食品中致病菌的检出率差异较大,生肉中致病菌的检出率高居榜首为49.33％,主要污染菌为沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌;沙拉中致病菌的检出率为17.39％,主要污染菌为单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌;生食水产品中致病菌的检出率为16.94％,主要污染菌为单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性孤菌;熟肉制品中致病菌的检出率为9.84％,主要污染菌为单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌;中式凉拌菜中致病菌的检出率为8.89％,主要污染菌为金黄色葡萄球菌;鲜榨果汁中致病菌的检出率为6.67％,主要污染菌为金黄色葡萄球菌;鲜冻水产品中致病菌的检出率为5.00％,主要污染菌为副溶血性弧菌;婴幼儿配方粉/米粉/谷粉/豆奶粉中阪崎杆菌的检出率为1.11％.结论 山西省多种食品均存在食源性致病菌不同程度的污染,应加大对散装食品、即食食品和生食水产品的监管.     

Comparison of pathogenic and spoilage bacterial levels on refrigerated poultry parts following treatment with trisodium phosphate

This study was undertaken to determine whether trisodium phosphate decontamination of poultry could give a competitive advantage to pathogens and increase microbiological risk to consumers. Chicken legs were co-inoculated with similar concentrations of pathogenic (Salmonella Enteritidis or Listeria monocytogenes) and spoilage (Pseudomonas fluorescens or Brochothrix thermosphacta) bacteria. Samples were dipped in TSP (12%, 15 min) or were non-treated (control). Microbiological analyses were carried out at 0, 1, 3 and 5 days of storage (3 degrees C). Levels of spoilage bacteria were higher than those of S. Enteritidis on both treated and non-treated legs. Similar bacterial loads were observed for L. monocytogenes and B. thermosphacta. However, P. fluorescens counts on TSP-treated samples were significantly lower than those of L. monocytogenes at all sampling times. Our results found that P. fluorescens (a spoilage organism) was more susceptible to TSP treatment than L. monocytogenes when inoculated at 10(6) cfu g(-1).     

3 种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

应用靶序列富集多重聚合酶链式反应（target-enriched multiplex-polymerase chain reaction,Tem-PCR）技术建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3 种食源性致病菌的快速检测方法。分别以金黄色葡萄球菌femA基因、沙门氏菌invA基因和志贺氏菌ipaH基因为靶基因,设计3 对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了Tem-PCR检测方法。结果显示,建立的Tem-PCR方法特异性强,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别为1.1×103、2×103 CFU/mL和1.2×103 CFU/mL。Tem-PCR检测方法有效地解决了传统多重PCR引物扩增效率不均衡的问题。