Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗在动物体内的免疫原性及安全性评价

目的评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliovirus vaccine derived from Sabin strain,s IPV)在动物体内的免疫原性和安全性。方法利用篮式生物反应器在Vero细胞上培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,收获病毒液,经超滤浓缩、柱层析纯化、病毒灭活后,制备三价s IPV,参考《中国药典》三部(2010版)相关附录方法检测宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、宿主细胞DNA及牛血清白蛋白残留量,HPLC法检测纯度;采用SDS-PAGE、Western blot法及透射电子显微镜对病毒的特异性进行鉴定;将s IPV于第0和21天免疫Wister大鼠,微量中和法检测免疫后大鼠血清中和抗体水平,并与野毒株IPV(IPV derived from wild strain,w IPV)组进行比较;通过观察ICR小鼠单次肌肉和静脉注射给予s IPV后产生的毒性反应及豚鼠反复给予s IPV后出现的速发型全身过敏反应,评价疫苗的安全性。结果 s IPV残余牛血清白蛋白、宿主细胞DNA、HCP检测结果分别低于2.5 ng/ml、100 pg/ml和100 ng/ml,疫苗纯度达95%以上;病毒形态及直径大小与脊髓灰质炎病毒一致,兔抗脊髓灰质炎病毒多克隆抗体可与对应型别的脊灰病毒的VP1、VP2、VP3发生特异性抗原抗体结合反应,相对分子质量分别在31 000~38 000、27 000~32 000和26 000~28 000之间;二免后,s IPV大鼠血清中和抗体阳转率及GMT均高于w IPV组;小鼠的急性毒性和豚鼠全身主动过敏反应均为阴性。结论制备的s IPV具有良好的免疫原性和安全性。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液蛋白成分分析

目的 对本公司研发的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液进行蛋白成分分析及鉴定。方法 按照疫苗生产工艺,应用NBS篮式生物反应器生产单价脊髓灰质炎病毒原液,经超滤浓缩及分子筛和阴离子交换两步柱层析纯化方法,收集并灭活蛋白峰。透射电镜下观察病毒形态及大小;ELISA方法检测宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)及残留牛血清白蛋白含量;HPLC法分析单价灭活病毒纯化液纯度;液相色谱(liquid chromatography,LC)与电喷雾电离质谱(electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS)相结合的技术鉴定样品中所含蛋白成分。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液中可见球形病毒颗粒,直径25~30 nm;HCP、残余牛血清白蛋白含量分别低于50 ng/ml、2.5μg/ml;纯度大于95%;单价脊髓灰质炎病毒样品中含有相应血清型的脊髓灰质炎病毒基因组编码蛋白,且相应病毒蛋白成分数据库匹配相对分值在所含蛋白组分中均最高。结论 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒液经纯化后,有效去除了杂质蛋白保留了病毒蛋白组分,单价病毒纯化液病毒蛋白成分明确,纯度较高,为后续该疫苗的研发与生产提供了参考。     

生产过程中Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗的灭活效果验证

目的 对Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin inactivated poliovirus vaccine,sIPV)在生产过程中的灭活效果进行验证及评价.方法 分别制备Sabin株Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型脊髓灰质炎病毒连续5批纯化液,加入终浓度为92.5 μg/mL的甲醛,37℃灭活12d.收集灭活前(0 d)及灭活1～6...     

二乙烯亚胺对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株的灭活效果

目的观察二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,BEI)对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株的灭活效果。方法在不同温度(37、33、28和25℃)下采用4种浓度(0.002、0.001、0.0005和0.00025mol/L)的BEI及0.0925mg/ml的甲醛对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株进行灭活,采用微量滴定法测定病毒感染性滴度,ELISA法检测灭活病毒液D抗原含量,并进行病毒灭活验证试验。结果在37℃条件下,0.002mol/L的BEI能在48h内完全灭活病毒,灭活后的病毒液D抗原含量回收率为90.6%,显著高于甲醛灭活的回收率(60.6%)。经验证,灭活彻底,无活病毒存在。结论 BEI对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株的D抗原破坏小,能较好地保持疫苗的有效成分。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗对大鼠的免疫效果

目的比较不同浓度Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin IPV)3针免疫大鼠的中和抗体效价,为确定Sabin IPV的最佳免疫方案提供参考。方法用不同浓度的Sabin IPV对52只Wistar大鼠进行3针免疫,每针间隔1个月,每次免疫后30d采血并分离血清,采用微量中和试验测定血清中抗脊髓灰质炎病毒3个型的中和抗体效价。结果大鼠经3针Sabin IPV免疫后,其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体的几何平均滴度均显著上升,2针免疫后抗体阳转率已经达到100%,且原倍疫苗与稀释疫苗免疫大鼠后,产生的中和抗体水平差异有显著意义。结论Sabin IPV在大鼠中有良好的免疫效果,经3针免疫可产生高水平的中和抗体。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性

目的分析Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine,sabin strain,s IPV)毒种(亚主种子、工作种子)及疫苗代次病毒(SO+4)的遗传稳定性。方法比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒的感染性滴度及D抗原含量的变化情况,并对上述病毒进行全基因组测序。结果各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62~8.62 lg CCID50/ml,D抗原含量均维持在30~128 DU/ml。与Gen Bank上登录的SabinⅠ(AY184219.1)、Ⅱ(AY184220.1)、Ⅲ型(AY184221.1)减毒株原始种子(SO)基因序列相比,Sabin株亚主种子(SO+2)、工作种子(SO+3)及疫苗代次病毒(SO+4)均未出现碱基突变。结论 s IPV毒种及疫苗代次病毒的全基因序列与原始种子相比,均未发生变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性。     

脊髓灰质炎病毒Sabin株工作种子批基因鉴别

目的研究脊髓灰质炎病毒Sabin株基因鉴别的方法。方法分别进行脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ型Sabin株和Ⅲ型Pfizer株3个型的工作种子批病毒RT-PCR,对扩增产物进行SDS-PAGE及测序。结果Ⅰ、Ⅱ型Sabin株和Ⅲ型Pfizer株3个型的工作种子批病毒分别出现了97、71和53bp的电泳带,与预期结果相符。扩增基因序列与报道的脊髓灰质炎病毒减毒株序列一致。结论RT-PCR可以用于脊髓灰质炎病毒Sabin株毒株鉴别。     

国产脊髓灰质炎灭活疫苗和口服减毒活疫苗序贯接种基础免疫效果评价

目的评价我国国产脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin株)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗序贯接种基础免疫的效果。方法采用同期非随机对照实验研究方法,于2015年9~12月期间,在宁夏回族自治区吴忠市同心县选择满2月龄健康儿童180人,按照国家规定的免疫程序,分别在2、3、4月龄各接种1剂次脊髓灰质炎疫苗。将上述儿童分为两组:一组采用t OPV+t OPV+t OPV的基础免疫程序(简称O-O-O组),另一组采用国产IPV(Sabin株)+t OPV+t OPV(简称I-O-O组)序贯接种的基础免疫程序。分别采集同一受种者免疫前和完成3剂次脊髓灰质炎疫苗基础免疫后30 d的血清标本,采用微量中和试验测定血清中3个脊髓灰质炎型别(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)的抗体滴度,计算GMT及抗体保护率。结果 3剂次脊髓灰质炎疫苗基础免疫程序接种完成后,I-O-O组脊髓灰质炎Ⅱ、Ⅲ型抗体滴度均高于O-O-O组;两组均获得较好的针对3种型别脊髓灰质炎病毒的抗体保护率,差异无统计学意义(P0.05)。结论国产IPV(Sabin株)和t OPV序贯接种的免疫程序能够提供与全程接种t OPV相似甚至更高的针对脊髓灰质炎病毒的免疫保护能力。     

抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备

目的制备抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体,为ELISA检测方法的建立奠定基础。方法将Ⅰ型脊髓灰质炎减毒疫苗原液和灭活疫苗原液经超滤、超离纯化,以纯化的减毒脊髓灰质炎病毒D抗原免疫BALB/c小鼠,得到的脾细胞与SP2/0-A14小鼠骨髓瘤细胞融合,以纯化的灭活脊髓灰质炎病毒D抗原建立间接ELISA法,筛选分泌特异性单抗的阳性细胞株,诱生小鼠腹水,通过正辛酸-硫酸铵法纯化抗体,并进行各项鉴定。结果获得两株稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒单抗的细胞株7G5及5E4。纯化的7G5和5E4株单抗分别可与脊髓灰质炎病毒D抗原的VP2、VP3衣壳蛋白结合;在不同温度下放置均比较稳定;pH4不利于7G5株单抗的保存;5E4株单抗的相对亲和力大于7G5株;7G5株单抗的亚类为IgM,5E4株单抗的亚类为IgG2a;两株单抗可识别相似表位;7G5株和5E4株单抗的中和效价分别为1:64和1:128。结论已成功制备了两株分泌抗脊髓灰质炎病毒的单抗。     

脊髓灰质炎病毒及其疫苗研究现状

脊髓灰质炎疫苗接种策略引发了全球根除脊髓灰质炎进程的转折。从口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)转向灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV),前者可能导致疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒循环和恢复毒力。目前使用的所有疫苗均来源于脊髓灰质炎病毒培养,Salk IPV还涉及野生型病毒。通过重组技术产生空的病毒衣壳,可以实现不使用病毒生产疫苗的目标,但迄今为止这样的病毒样颗粒(VLP)非常不稳定。本文对脊髓灰质炎病毒的生物学特性、脊髓灰质炎疫苗的发展现状及研究进展进行概述。     

感染复数对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响

目的观察不同感染复数(MOI)对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响。方法分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒感染Vero细胞,观察不同MOI致细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果病毒感染Vero细胞后48h,3组MOI(0.001、0.01、0.1)细胞病变均达莞。Ⅰ型病毒增殖高峰出现在接种后72h,3组MOI病毒滴度分别为(8.690±0.190)、(8.690±0.190)和(8.315±0.185)lgCCID50/ml;Ⅱ型病毒增殖高峰出现在接种后96h,3组MOI病毒滴度分别为(8.355±0.097)、(8.440±0.310)和(8.285±0.155)lgCCID50/ml;Ⅲ型病毒增殖高峰出现在接种后48～96h,3组MOI病毒最高滴度分别为(7.500±0.250)、(7.500±0.250)和(7.750±0.250)lgCCID50/ml。结论不同MOI对3型病毒增殖影响不大,可以采用低MO(I0.001)制备疫苗。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性

目的探讨Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性。方法用Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分别以0.01、0.1和1MOI接种Vero细胞,进行传代培养,共传13代。采用微量细胞病变法测定病毒滴度;双抗体夹心法测定D抗原含量;免疫Wister大鼠,采用微量中和试验测定病毒的免疫原性。结果Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在Vero细胞上连续传13代,病毒滴度基本稳定;D抗原含量呈下降趋势;免疫原性下降迅速。结论用Sabin株脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗,在Vero细胞上传代的代次越低越好。     

应用减毒株和强毒株试制脊髓灰质炎灭活疫苗的比较

作者采用单层猴肾细胞,接种中Ⅲ_2 及 Leon 株毒种。收获后的病毒悬液经澄清过滤,超滤浓缩后用 Sepharose CL 6B 凝胶过滤,再用 DEAE-Sephadex A_(50)进行离子交换层析提纯。最后加1/4000福尔马林,放37℃水浴灭活13天,制成灭活疫苗。疫苗中残余牛血清均低于60ng/ml,D-Ag 含量中Ⅲ_2 为2316Du/ml,回收率为64%;Leon 株为2068Du/ml,回收率为71%。分别免疫家兔均产生相当高(1024～8192)的血清中和抗体。     

应用7.5 L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的应用7.5 L生物反应器,培养Vero细胞和乙型脑炎病毒,规模化生产乙型脑炎灭活疫苗。方法应用7.5 L生物反应器,分别以5、10、15、20、25 g/L的微载体密度加装,采用灌流方式培养Vero细胞,分别将P3株乙型脑炎病毒按0.005 00、0.002 50、0.001 60、0.001 25、0.001 00 MOI接种至生物反应器内,收获乙脑病毒液。经浓缩、灭活、纯化等工艺制备疫苗半成品,经疫苗灭活及纯化试验进行工艺验证,合格后分装为疫苗成品,按照《中国药典》三部(2010版)中《冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)》要求,进行疫苗全项检定。结果当微载体密度为20、25 g/L时,细胞密度可达1.2×107个/ml,病毒滴度平均达8.33～8.52 lgLD50/ml;当病毒接种量为0.001 25 MOI时,病毒最高滴度可达9.02 lgLD50/ml。经超滤浓缩后的病毒原液,使用1∶4 000β-丙内酯灭活72 h,可达到灭活效果;纯化后可去除90%以上杂蛋白。应用7.5 L生物反应器生产的6批乙型脑炎灭活疫苗,经检定各项指标均符合国家要求。结论应用7.5 L生物反应器培养Vero细胞和P3株乙型脑炎病毒,经连续灌流收获,可规模化生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。     

脊髓灰质炎灭活疫苗在中国婴儿中的免疫持久性

目的评价脊髓灰质炎(简称脊灰)病毒灭活疫苗(Inactivated poliovirus vaccine,IPV)在中国婴儿中的免疫持久性。方法选择广西壮族自治区平乐县11个乡(镇)的372名健康婴儿,随机分为2组:176名婴儿分别于2、3、4月龄接种1剂IPV疫苗,196名婴儿分别于2、3、4月龄口服1粒脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸(Oral poliovirus vaccine,OPV)。两组均于基础免疫后1个月及18月龄时采集静脉血,采用微量中和试验检测血清中抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒中和抗体(Neutralizing antibody,NA)滴度。结果两组婴儿接种疫苗后18月龄时血清抗脊灰病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型NA几何平均滴度(Geometric mean titer,GMT)均明显低于基础免疫后1个月。18月龄时IPV组血清抗脊灰病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型NA阳性率明显低于基础免疫后1个月,且差异均有统计学意义(P均<0.001);OPV组差异无统计学意义(P=0.111)。IPV组部分婴儿在18月龄时血清抗脊灰病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型NA滴度小于1︰8,比例分别为11.4%、17.1%和18.2%。结论 IPV基础免疫后至18月龄时,婴儿抗脊灰病毒抗体保护水平下降,需进行加强免疫。     

兽用灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺的优化

目的优化兽用灭活纯化狂犬病疫苗的生产工艺。方法建立BHK21C13细胞主细胞库、工作细胞库,狂犬病病毒疫苗株LEP-Flury主种子批、工作种子批,并进行鉴定。优化悬浮培养工艺参数,并分析病毒原液浓缩、纯化和灭活过程中抗原及成品的稳定性。结果主细胞库、工作细胞库无外源因子污染,细胞形态、生长良好;狂犬病病毒主种子批和工作种子批无外源因子污染,病毒滴度最高可达107.8logLD50/ml。采用15L生物反应器,在优化的培养工艺条件下,细胞密度可达4.5×106个/ml,病毒按0.3MOI接种,灌流培养5次,病毒滴度平均可达106.8logLD50/ml。病毒原液合并后,经750KD中空纤维柱30倍浓缩,Sepharose Fast Flow6层析柱纯化,1/4000β-丙内酯灭活,期间加入稳定剂,纯化疫苗效价平均达(5.03±1.84)IU/头份,纯化的抗原量达(11.75±0.70)μg/头份,在4℃可保存24个月,在37℃可保存30d,在45℃可保存12h。结论优化的兽用灭活狂犬病疫苗的生产工艺可提高疫苗的安全性、有效性及稳定性。     

肝水解肽的制备及其病毒灭活/去除工艺的验证

目的制备肝水解肽,并对其病毒灭活/去除工艺进行验证。方法以鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)为指示病毒,在100℃,pH6.0～7.0煮沸20min灭活病毒,用截留相对分子质量为10000的中空纤维柱,在进压0.15Mpa、回流压0.05Mpa和进压0.20Mpa、回流压0.10Mpa各循环超滤3次去除病毒,用无特定病原(SPF)的鸡胚和鸡成纤维细胞进行病毒灭活/去除的效果验证。结果加热煮沸后,指示病毒未检出,滴度降低NDV≥7.4logEID50/0.2ml、IBDV≥5.45logCCID50/0.1ml;超滤后IBDV未检出,滴度降低≥5.43logCCID50/0.1ml。盲传复壮均未检出病毒。制备的肝水解肽多肽含量均在20mg/ml以上。结论制备的肝水解肽工艺中两种灭活/去除病毒方法均有效,经灭活/去除病毒后的产品质量稳定。     

悬浮吸附法在人胚肺二倍体细胞(KMB17)中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒

目的研究在KMB17细胞中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒及其用于生产疫苗的可行性。方法应用悬浮吸附和添加血清的方法,在KMB17细胞上培养SabinⅠ、Ⅱ、中Ⅲ2型病毒,用微量法检测病毒滴度。结果在悬浮吸附加10%血清培养条件下,SabinⅠ滴度可达8.125 LgCCID50,SabinⅡ滴度可达7.5 LgCCID50,中Ⅲ2滴度可达7.583 LgCCID50。与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度比较,差异无显著意义(P>0.05)。结论可进一步研究应用KMB17细胞进行疫苗生产。