瘤胃菌中乳酸脱氢酶的异源表达与酶学性质研究

乳酸脱氢酶（ldh）在辅酶 NAD⁺/NADH 的作用下能催化乳酸与丙酮酸的可逆转化。本研究从实验室保藏的瘤胃菌 R1 菌株中克隆出 ldh 基因并构建了 pEGX 6p-1-ldh 重组质粒,将其导入 E.coli BL21（DE3）中实现了 ldh 异源表达。通过生物信息学分析,ldh 呈疏水性,为胞外酶,不存在跨膜结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,具有高度保守的功能位点和结构域。通过酶学性质分析,重组ldh 最适反应温度为 45 ℃,最适反应 pH6.5,Na⁺、Mn²⁺和Co²⁺对ldh酶活有促进作用。     

产高纯度L-乳酸大肠杆菌基因工程菌的初步研究

本文以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)基因组为模板,扩增出L-乳酸脱氢酶基因ldh,将其连接到表达载体pSE380,转化到D-乳酸脱氢酶及丙酮酸甲酸裂解酶双缺失的大肠杆菌FMJ144中,摇瓶发酵得到3.5g/L的高纯度为99%的L-乳酸。     

重组大肠杆菌合成光学纯L-苯基乳酸

以巨大芽孢杆菌Z2013513基因组DNA为模板,分别PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因(ldh L)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh),将gdh与ldh L分别连接至表达载体p ETDuet,获得共表达质粒p ETDuet-ldh L-gdh。经转化和验证获得重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/p ETDuet-ldh L-gdh。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和比酶活力分析表明重组蛋白L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶均成功表达且具有酶活力。在37℃、200 r/min条件下,经60 min反应,催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。产物L-苯基乳酸光学纯度(99%),底物摩尔转化率(59.55%),结果表明此重组体系可用于高效合成高光学纯L-苯基乳酸。     

L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325中的表达

本文研究了在m RNA转录水平上三种L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325不同生长阶段的表达情况。以16s r RNA作为内参基因,应用实时荧光定量PCR技术测定不同生长阶段的菌体中L-乳酸脱氢酶基因(ldh、ldh X和ldh B)表达的动态变化规律。该菌株的生长曲线呈S型,培养2~6 h为菌体的生长对数期,随后进入稳定期。生长曲线的测定表明该菌株生长力极其旺盛;16s r RNA、ldh、ldh X和ldh B基因的扩增效率曲线显示,内参基因与目的基因的扩增效率一致且接近100%,这说明利用相对荧光定量法能够较好的反应目的基因的表达量;ldh、ldh X和ldh B基因在菌体生长的3个时间点(6 h、9 h和12 h)都有一定量的表达,随着菌体的不断生长,基因表达的变化均呈现显著性上升趋势,且上升幅度不断增加,在12 h时基因表达量达到最大值。其中ldh基因在的表达量在菌体生长的3个时间点存在显著性差异,而ldh X、ldh B基因的表达量存在极显著差异。     

ldhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TCCC11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△ldh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因ldhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的。结果表明,与出发菌株相比ldhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6%,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6%和5.5%,但生物量略有下降。本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考。     

1dhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822 发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（Corynebactenum glutamicum） TCCC 11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△1dh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因1dhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的.结果表明,与出发菌株相比1dhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6％,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6％和5.5％,但生物量略有下降.本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考.     

谷氨酸棒杆菌代谢副产物对α-酮戊二酸积累的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可以催化丙酮酸转化生成乳酸,ackA和pqo基因编码乙酸激酶和丙酮酸:醌氧化还原酶,可以催化丙酮酸转化为乙酸.为了研究这三个基因缺失对谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸积累的影响,以Cglutamic um GDK-10为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建ldh,pqo,ackA,pqo和ackA基因缺失突变株GDK-14,GDK-15,GDK-16,GDK-17.对出发菌及上述重组菌株进行发酵验证比较,发酵结果表明:ldh和pqo基因缺失菌株的α--酮戊二酸产量分别比出发菌降低了8.54％和27.9％,而ackA基因的缺失使α-酮戊二酸产量比出发菌提高了8.99％.     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

米根霉产L-乳酸耐温菌株的60Co-γ射线诱变选育

目前产L-乳酸的米根霉菌株的最适发酵温度为32℃,该温度较低,不利于产物分离且易染杂菌。以米根霉As3.819为出发菌株,采用60Co-γ射线进行诱变处理,以正突变率为指标,诱变剂量为400Gy,通过筛选得到耐38℃高温的5号突变株mut-5,经连续传代7次,遗传性状稳定。与出发菌株相比,发酵72h后,mut-5突变株发酵液中的乳酸含量提高了24.15%,乙醇含量降低了9.27%。乳酸脱氢酶(LDH)比活力提高了39.41%,乙醇脱氢酶(ADH)比活力有所下降,而对还原糖的利用速率以及生物量的积累均高于出发菌株。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的高效表达

海栖热袍菌 Thermotoga maritima 是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的极耐热葡聚糖酶具有很好的热稳定性和潜在的可观工业用途。但嗜高温菌基因在大肠杆菌中表达水平较低,T．m 内切葡聚糖酶 Cel12B 基因带有信号肽,应用在线预测分析,通过 PCR 方法分别克隆 Cel12B 完整基因和不带信号肽基因至 pET-20b 载体, 构建重组质粒 pET-20b-Cel12B 和 pET-20b-Cel12B-WS,转化至大肠杆菌 JM109DE3诱导表达后,分析酶活,结果表明去除信号肽重组菌单位酶活是未去除信号肽重组菌11倍多。     

Antibacterial activity of Bacillus amyloliquefaciens phage endolysin without holin conjugation

To characterize the enzymatic activity and antibacterial activity of endolysin encoded by a Bacillus amyloliquefaciens phage, the open reading frame encoding endolysin was amplified by PCR and cloned into the expression plasmid pET21d(+). The resultant plasmid was used to transform Escherichia coli JM109(DE3). Production of endolysin in the cytosol facilitated cell lysis without coproduction of holin, which is considered to degrade or alter the cytoplasmic membrane. The phage endolysin was overexpressed and purified. Although the specific activity of the purified phage endolysin towards lyophilized Micrococcus luteus cells was 1/11 of the activity of chicken egg white lysozymes, the endolysin showed stronger antibacterial activity towards E. coli W3110, E. coli JM109(DE3) and Pseudomonas aeruginosa PAO1 than chicken egg white lysozymes. The antibacterial activity of the endolysin towards these three bacterial strains was marked when EDTA was added to the endolysin solution.     

嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC的克隆及组氨酸融合酶蛋白的表达

应用PCR扩增嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC,重组至原核表达载体pET30b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达的重组乙醛脱氢酶在碳端含有一个组氨酸标签。SDS-PAGE考察蛋白的表达量和亚基分子量,并对Km值进行了考察。成功构建了pET30b-aldC原核表达质粒;诱导表达了亚基分子量约为56 kDa的组氨酸融合蛋白;乙醛脱氢酶活性比对照菌增加了约3.5倍;Km值为2.874 mmol/L。成功克隆并诱导表达了含组氨酸标签的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC。     

野油菜黄单胞菌产胶基因GumD克隆与重组质粒的构建

目的:建立野油菜黄单胞菌产胶基因GumD的克隆与重组质粒构建的方法。方法:以优化PCR实验条件扩增得到野油菜黄单胞菌产胶基因GumD片断,与抗药性质粒pMD18-T连接,获得重组质粒,并用CaCl2法转化JM109大肠杆菌细胞。结果:DNA测序结果表明,成功克隆产胶基因和构建重组质粒。结论:此方法可用于克隆野油菜黄单胞菌产胶基因和构建产胶基因重组质粒。     

A microscopic method to visualize Escherichia coli interaction with beef muscle

The genetic determinant for enhanced green fluorescent protein (EGFP) was introduced into Escherichia coli JM109 (ATCC 53323) and E. coli O157:H7 (ATCC 43895) on plasmid EGFP. The expression of EGFP did not change the growth kinetics or surface properties tested (hydrophobicity and electrophoretic mobility). Microscope slides were modified to allow for optimal viewing of thick meat samples with an inverted microscope. Two fluorescent dyes, nile red and Cy3 were used to stain for lipid and protein portions of beef muscle, respectively. Laser scanning confocal microscopy was used to observe interaction of the EGFP-expressing E. coli strains and the fluorescently stained muscle components without changing the spatial and temporal environment of the organisms.     

北京棒杆菌高丝氨酸脱氢酶基因的克隆与表达产物活性测定

以北京棒杆菌E31染色体DNA为模板,用PCR法扩增了高丝氨酸脱氢酶(HD)基因。将结构基因装载于pET-28a质粒的T7启动子下游,得到了重组表达质粒pET-HD。将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明,高丝氨酸脱氢酶的活性为不含重组质粒的对照菌的10倍。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。