RNAi及其抗口蹄疫病毒研究进展

RNAi(RNA interference)技术为基因功能分析提供了有效的手段,并在抗病毒的基因治疗及防控研究中取得了一些阶段性成果.笔者综述了RNAi及其抗病毒研究的现状,重点回顾了RNAi抗口蹄疫病毒(FMDV)的研究进展,并对RNAi抗病毒研究前景进行了展望.     

植物基因沉默机制研究进展

综述了植物体中转录水平、转录后水平基因沉默及RNA干扰(RNAi)导致基因沉默的机制,并阐述了RNAi技术在植物基因工程中的广泛应用.     

RNA干扰沉默HMGN5基因对肺癌H1299细胞增殖和周期的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默高迁移率族核小体结合域5(HMGN5)基因对肺癌H1299细胞增殖和细胞周期的影响,为肺癌的基因靶向治疗提供理论依据.方法:构建HMGN5特异性siRNA慢病毒载体,感染肺癌H1299细胞,设阴性对照组及干扰组,应用Real-time PCR和Western blotting方法分别从mRNA和蛋白质水平检测各组干扰质粒对HMGN5基因的干扰效果,MTT和BrdU法检测HMGN5 siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果:与阴性对照组比较,干扰组HMGN5的mRNA表达量下降了50.7%(P< 0.05),蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;BrdU实验RNAi干扰组细胞增殖率(37.8%)明显低于对照组(55.0%)(P< 0.05);流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(54.6%±0.9%)高于阴性对照组(46.5%±0.4%)(P< 0.05).结论:运用RNA干扰技术能够有效沉默H1299细胞的HMGN5基因,并抑制肺癌细胞的增殖能力,提示HMGN5在肺癌的发生发展中起重要作用,抑制HMGN5的表达可能成为一种治疗肺癌的方法.     

丙肝病毒感染者血清乙肝病毒标志物与肝功能情况分析

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝病的主要致病因子,并与肝硬变、肝癌的发生密切相关[1].由于这两种病毒具有相似的传播途径,所以HBV和HCV的合并感染比较常见,流行率约10%～15%[2,3].     

谈输血前检查的结果分析对临床输血的意义

目的了解拟输血患者在输血前乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒的携带情况,减少因输血引起的医疗纠纷.方法对1366例拟输血的病人进行乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体抗(HCV)、人类免疫缺陷病毒抗体抗(HIV)、梅毒螺旋体抗体抗2TP四项常见传染病指标进行检测.结果HBsAg阳性168例,HCV阳性28例,抗HIV阳性15例,抗TP阳性48例.结论对受血者输血进行输血前四项传染病指标检测,可以加强医院感染的预防,有利于患者的治疗,并可加强医护人员的自我保护和减少因输血引起的医疗纠纷.     

HBV感染者血清标志物与HBV DNA检测结果的关联性分析

乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白包括S、前S2和前S1 3种成分,含有前S1的蛋白主要存在于Dane颗粒和管型颗粒上,pre-S1 Ag(pre-S1 Ag)检测是对乙肝"两对半"特别是e抗原和HBV-DNA检测的重要补充.pre-S1 Ag和HBV DNA能反映病毒的状态,但基层医院一般不具备HBV DNA检测所需PCR设备,而具有pre-S1 Ag检测的ELISA仪器,且检测pre-S1 Ag费用低、方便快捷.为了解HBV感染者血学标志物与HBV DNA的关联性,本文作者将247例HBV感染者血清标志物pre-S1 Ag与HBV DNA检测结果报道如下.     

干扰素r联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的初步观察

干扰素a(IFN-a)联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎及病毒携带者已被国内外肝病专家公认,但干扰素r(IFN-r)抗乙型肝炎病毒鲜见报道.为探讨其疗效,我们选择300例患者,分3组抗病毒治疗,结果报道如下.     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫BALB/e小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体.结果 成功构建了pET28a(+)-E原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,获得了1株持续分泌抗E蛋白抗体的杂交瘤细胞株8B3,该单抗为IgG2a亚类.结论 成功制备了抗E蛋白mAb,为对登革病毒引起感染的早期诊断提供了有力的工具.     

湘文一号抗虫棉幼叶总RNA提取技术研究

棉花抗虫Bt基因克隆技术第一步就是从抗虫Bt基因特异性表达的幼叶中提取总RNA,基因的表达可以在RNA产生的不同阶段进行调控,纯化完整的总RNA是进行基因表达研究和从cDNA克隆新基因的基础.对比分析了CTAB-licl法、改良异硫氰酸胍一步法、Trizol一步法和试剂盒提取方法4种RNA提取技术,经琼脂糖凝胶电泳谱带结果检验和紫外分光光度计检测,发现前2种方法很难提取到理想的RNA,而后2种提取的RNA完整性较好,但用RNA Out试剂盒提取的RNA更加适用于反转录cDNA.     

特异性下调GRP78基因表达对卵巢癌细胞耐药性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因对人卵巢癌细胞耐药性的影响,阐明GRP78基因沉默逆转肿瘤细胞耐药性的生物学机制.方法:构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3/DDP细胞;RT-PCR和Western blotting法检测GRP78基因的蛋白的表达;Western blotting法检测caspase-4和caspase-3蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:转染GRP78 siRNA重组质粒的SKOV3/DDP细胞GRP78基因和蛋白表达较转染空质粒组明显降低(P<0.05);加用顺铂后,转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组较未转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组caspase-4和caspase-3表达明显增加(P<0.05),细胞凋亡率也明显增加(P<0.05).结论:抑制GRP78基因表达能通过上调caspase-4和caspase-3表达及增加顺铂诱导的SKOV3/DDP细胞凋亡率,降低SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性.     

中国人经典霍奇金淋巴瘤中人类白细胞共同抗原表达的研究

目的 既往的研究发现在高加索人中,经典霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞人类白细胞共同抗原(HLA)的表达与EB病毒感染密切相关,研究在亚洲人中两者的相关性.方法 随机选取北京大学医学部病理学系常规外检及会诊病例中确诊为经典霍奇金淋巴瘤的145例,所有病例均有石蜡包埋组织蜡块.常规HE染色、形态学观察,根据WHO分类标准对所有病例进行重新分类.原位杂交方法检测EB病毒编码的小RNA(EBER)以提示肿瘤与EB病毒的相关性.HLA-Ⅰ类抗原的表达使用HC-10和β 2-微球蛋白抗体检测,而HLA-Ⅱ类抗原的表达使用CR3/43抗体检测.结果 145例中,40%(58例)的病例为EB病毒相关性.EB病毒阳性病例中,混合细胞型较结节硬化型更为常见(71%比16%,P＜0.001).HLA-Ⅰ类抗原在EB病毒阳性病例中的表达率明显高于EB病毒阴性的病例(79%比30%,P＜0.001).而HLA-Ⅱ类抗原的阳性率在EB病毒阳性和阴性病例中差异无统计学意义(52%比43%,P=0.277).结论 中国人经典霍奇金淋巴瘤HLA-Ⅰ类抗原的表达与EB病毒感染密切相关,与高加索人一样,但HLA-Ⅱ类抗原的表达与EB病毒感染无显著相关性.     

藏系绵羊MSTN基因在不同年龄不同组织的表达定量研究

[目的]研究MSTN基因在藏系绵羊不同年龄、不同组织的表达差异.[方法]根据Gen Bank已发表序列(NM 001009428.1)设计1对引物,以藏系绵羊组织总RNA为模板,采用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR)分析了MSTN塞因在不同年龄阶段的真胃、瘤胃、腿肌和心肌中的基因表达量.[结果]经过内参基因校正后,综合4个组织分析,MSTN基因在6月龄藏系绵羊的相对表达量最高,是12月龄藏系绵羊的2.52倍,是羔羊的2.24倍,是9月龄的1.30倍(P<0.05).且MSTN基因在腿肌中的表达量最高,在其他组织几乎未表达,在腿肌中的表达量是其瘤胃的3984.78倍,是心肌的602.69倍(P<0.01).[结论」为MSTN蛋白抗体的正确利用奠定了基础.     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因.[方法]对应用抑制差减杂交枝术(SSH)获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测.[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性.[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用.     

乙型肝炎病毒基因型和基因变异在乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎中的意义

目的:探讨HBV基因型及基因变异等病毒因素在HBV-GN中的意义.方法:选择41例HBV-GN患者,采用荧光PCR法检测HBV-GN患者基因型,HBV多态性芯片检测基因变异,同时测定尿常规、肾功能和血压等临床资料.结果:41例HBV-GN患者,B基因型14例,C型24例(86.8%),B+C混合型3例.B型和C型患者间24小时尿蛋白有显著性统计学差异(P＜0.05),尿红细胞计数、血压、尿素氮和血清肌酐无显著性统计学差异(均P >0.05).12例为前C区1896位变异,1896位变异与未变异者间小便常规,血压和肾功能无显著性差异.结论:HBV-GN患者HBV基因以B、C两型为主,C型为多.C型患肾脏损害可能更为严重.前C区1896位变异和YMDD变异对HBV-GN患者小便常规、血压和肾功能无明显影响.     

甲基化寡核苷酸灭活死亡相关蛋白激酶1基因对白血病K562细胞增殖的影响

目的 探讨互补甲基化寡核苷酸诱导灭活K562白血病细胞死亡相关蛋白激酶1基因(DAPK1)及对其增殖的影响.方法 应用Lipo2000将与DAPK1基因启动子序列互补的甲基化寡核苷酸转染进K562白血病细胞,分别应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和反转录PCR(RT-PCR)检测转染前后DAPK1基因启动子甲基化状态和mRNA表达改变.应用噻唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞增殖变化.结果 正常组K562细胞的DAPK1基因启动子表现为未甲基化状态,可检测到相应mRNA表达;对照组寡核苷酸转染后,DAPK1基因启动子表现为未甲基化状态,mRNA表达和细胞增殖速度与正常组无明显差异;互补甲基化寡核苷酸转染后,DAPK1基因启动子呈甲基化状态,mRNA呈低表达状态,细胞增殖速度较正常组、甲基化对照寡核苷酸转染组显著增加.结论 互补甲基化寡核苷酸可诱导灭活K562白血病细胞DAPK1基因并抑制其mRNA表达,促进细胞增殖.     

交配和黑光灯处理对棉铃虫Helicoverpa armigera生物钟基因cryptochromes mRNA表达的影响

[目的]明确交配和黑光灯处理对棉铃虫生物钟基因.ptochromes mRNA表达的影响.[方法]应用实时定量PCR(SYBR Green)技术检测不同条件下棉铃虫cryptochromes(cry1和cry2)基因的表达,提取棉铃虫头部总RNA,经DNase I消化后进行反转录合成cDNA,并采用特异性引物分别对cry1、cry2和EF-1α基因进行实时定量PCR扩增.{结果]黑光灯处理棉铃虫2h,其crv1 mRNA的表达量明显降低;cry2 mRNA的表达量小于对照,但两者之间差异性并不显著:交配时棉铃虫cry1和cry2 mRNA表达均存在显著影响,并且雌、雄两性cry1和cry2 mRNA表达量在交配后随时间延长呈下降趋势.[结论]该结果对进一步研完cry基因的功能以及棉铃虫防治具有重要意义.     

广西地区甘蔗黄叶病病毒分子鉴定

[目的]为广西甘蔗黄叶综合征(YLS)的分子检测和抗病育种提供参考.[方法]采集显症甘蔗叶样本.通过提取总RNA,利用引物P1/P2对样本进行反转录RCR(RT-PCR)扩增,对广西地区甘蔗黄叶病的病原体进行分子鉴定.[结果]经引物P1/P2扩增出630by的目的片段.氨基酸和核苷酸序列分析结果表明,该片段是甘蔗黄叶病毒(SCYLV)外壳蛋白基因的一部分,与其他国家SCYLV分离物同源性达95%～99%.[结论]广西甘蔗黄叶病病原确是SCYLV,该病毒可能是近年从区外或境外传入的.     

水稻瘤矮病毒S3和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpFBDS3-S8转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒.结果表明:Sf9昆虫细胞被侵染72 h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物质,部分细胞破裂甚至裂解,说明S3和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中,这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础.     

PTEN、MLL基因在T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病的表达及其意义

目的 分析肿瘤抑制基因PTEN、混合系白血病(MLL)基因等在T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)的表达及意义.方法 选用76例T-LBL/ALl患者淋巴结存档蜡块,应用免疫组织化学EnVision法进行 PTEN标记,用20例反应性增生淋巴结标本作正常对照.并用荧光原位杂交(FISH)技术检测MLL基因所在1 1q23染色体的断裂和扩增情况.结果 76例T-LBL/ALL中,PTEN的表达率为64.47%(49/76),低于淋巴结反应性增生的100%(20/20)(λ2=19.220,P＜0.05).PTEN表达与临床分期、Ki-67、乳酸脱氢酶(LDH)呈负相关(P＜0.05).76例T-LBL/ALL中,MLL基因发生1 1q23染色体断裂13例(17.11%),扩增18例(23.68%).MLL基因断裂组总体生存率(25.0%)低于非断裂组(43.6%)(λ2=11.357,P＜0.05).MLL基因扩增组总体生存率(17.1%)低于非扩增组(42.7%)(λ2=4.533,P＜0.05).结论 抑癌基因PTEN表达降低在T-LBL/ALL的发生发展中可能具有重要作用.MLL基因发生染色体1 1q23断裂和扩增有助于对T-LBL/ALL预后的判断,发生MLL基因断裂或扩增的T-LBL/ALL预后较差,提示MLL基因断裂或扩增可能为T-LBL/ALL的一种分子亚型.     

RNA干扰PTEN基因对HCT-8细胞增殖能力的影响

目的:观察小干扰RNA(siRNA)对结肠癌相关基因PTEN表达的抑制作用及其对结肠癌细胞增殖能力的影响.方法:构建携带有针对PTEN基因序列的siRNA真核绿色荧光表达载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4,脂质体法转染入结肠癌HCT-8细胞(分别为p1、p2、p3和p4组),同时设转染阴性对照质粒组(p5组)和亲本细胞组(p6组),实时 PCR方法检测PTEN mRNA表达,MTT法分析细胞增殖活性变化.结果:通过荧光显微镜观察计数,细胞转染率为58%.实时 PCR方法检测结果显示,siRNA 重组质粒pGPU6/GFP/Neo-PTEN-1、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-2、pGPU6/GFP/Neo-PTEN-3和pGPU6/GFP/Neo-PTEN-4的抑制率分别为48.3%、76.5%、29.4%和61.2%,与p6组比较差异均有统计学意义(P<0.05).MTT结果表明,细胞增殖抑制能力明显增强.结论:PTEN基因在肿瘤的发生发展中可能起到一定的作用.