微生物来源柚苷酶的研究进展及应用

柚皮苷是影响柚子汁品味的最主要因素,柚苷酶具有将柚皮苷分解为普鲁宁、鼠李糖、葡萄糖和柚皮素等物质的功能,并且这些物质已广泛用于制药和饮料行业。本文介绍了近年来国内外微生物来源的柚苷酶的研究、酶学特性、酶活测定、结构与功能等,表明细菌来源的柚苷酶最适温度为37～70 ℃,最始pH值为4.5～8.0;真菌来源的柚苷酶最适温度为30～75 ℃,最始pH值为4.0～11.0。介绍了柚苷酶及其相关产物在食品、饮料和制药工业中的应用进展,发现柚苷酶不仅具有脱苦的作用,还对人类的身体健康具有重要作用。展望了今后的研究方向,应该从柚苷酶高产菌株的选育、发酵产酶的工艺优化和酶的应用等方面开展工作,大幅度提高柚苷酶的产酶水平。     

短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基的优化

胸苷磷酸化酶在核苷类物质合成中具有重要作用,本研究以短乳杆菌为胸苷磷酸化酶生产菌种,对短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基进行优化。首先通过Plackett-Burman设计筛选出影响短乳杆菌产胸苷磷酸化酶的3个较为重要因素：发酵时间（P=0.030）、接种量（P=0.033）和葡萄糖浓度（P=0.019）。在此基础上采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并利用响应面中心组合设计对影响显著因素进行优化,得到最适培养基组成成分和培养条件为：发酵初始pH 8.0,葡萄糖18 g/L,酵母膏15 g/L,NaCl 7.5 g/L,蛋白胨10 g/L,胸苷15 mmol/L,摇床转速110 r/min,发酵温度38 ℃,发酵时间10.57 h,接种量1.54%。在此优化条件下,短乳杆菌产胸苷磷酸化酶能力得到了很大提高,短乳杆菌胸苷磷酸化酶活从0.400 U/mg湿菌体提高到1.172 U/mg湿菌体,比优化前提高了2.93倍。蛋白质凝胶电泳分析显示经优化后每克湿菌体胸苷磷酸化酶的含量明显高于优化前。     

基因工程菌毕赤酵母发酵产纤维二糖酶条件研究

本文对基因工程菌毕赤酵母产纤维二糖酶活的发酵条件进行研究,结果表明:确定最优摇瓶培养基为小麦B浆4%,硫酸镁0.05%,玉米浆1%。其摇瓶最佳产酶条件为诱导时间12h,诱导前适宜的增殖时间为16h,接种量10%,转速220r/min,发酵pH值为6。在此基础上进行了50L发酵罐发酵中试,50L发酵罐诱导产酶高达125U。     

磁性硅基壳聚糖微球固定化柚苷酶水解柚皮苷的研究

本文在磁性Fe3O4外包覆一层SiO2,再在其外包裹壳聚糖制备出磁性硅基壳聚糖微球（MSC）,对MSC进行环氧基修饰后用于柚苷酶的固定化研究,并对磁性硅基壳聚糖微球固定化柚苷酶水解柚皮苷的pH、温度、操作和储藏稳定性进行了考察。通过单因素实验,确定了环氧基修饰的磁性硅基壳聚糖微球（MSCE）固定化柚苷酶的最佳工艺条件为：pH 3.0,温度30 ℃,时间4 h、给酶量57.48 U/mL。在此条件下,MSCE固定化柚苷酶的载酶率、酶活回收率和酶比活力分别为31.29%、88.92%和409.33 U/g。与游离柚苷酶相比,MSCE固定化柚苷酶用于水解柚皮苷具有良好的pH稳定性和温度稳定性,重复使用8次后仍具有53.36%的相对酶活力,4 ℃条件储存一个月后仍具有80.97%的相对酶活力。     

磁性硅基壳聚糖微球固定化柚苷酶水解柚皮苷

在磁性Fe3O4外包覆一层SiO_2,再在其外包裹壳聚糖制备出磁性硅基壳聚糖微球(MSC),对MSC进行环氧基修饰后用于柚苷酶的固定化研究,并对磁性硅基壳聚糖微球固定化柚苷酶水解柚皮苷的pH、温度、操作和储藏稳定性进行了考察。通过单因素实验,确定了环氧基修饰的磁性硅基壳聚糖微球(MSCE)固定化柚苷酶的最佳工艺条件为:pH 3.0,温度30℃,时间4 h、给酶量57.48 U/mL。在该条件下,MSCE固定化柚苷酶的载酶率、酶活回收率和酶比活力分别为31.29%、88.92%和409.33 U/g。与游离柚苷酶相比,MSCE固定化柚苷酶用于水解柚皮苷具有良好的pH稳定性和温度稳定性,重复使用7次后仍具有53.36%的相对酶活力,4℃条件贮存30 d后仍具有80.97%的相对酶活力。     

两步生物法转化柚皮苷制备L-鼠李糖

考察了利用柚苷酶和酵母静息细胞作为催化剂,两步生物法转化柚皮苷制备L-鼠李糖的工艺过程。柚苷酶水解柚皮苷的最佳工艺条件是ρ(柚皮苷)=14 g/L的水溶液为底物,加酶量10 mL/L(即每升底物中加入酶的体积,下同),pH=5.5,酶解时间22 h。酵母代谢葡萄糖的最佳工艺条件是酵母用量2.5 g/L(即每升水解液中加入酵母的质量,下同),温度32℃,pH=6.0,发酵时间120 min。在30 L发酵罐中进行了小试,最终获得了质量分数大于98.5%的鼠李糖结晶85.6 g,为理论得率的86.5%。     

产柚苷酶菌株的初步筛选

柚苷酶作为沙田柚和柑桔果实中主要苦味物质的分解酶有望在深加工生产中得到应用。本研究在沙田柚树林下土壤和沙田柚皮腐烂液中分离了多株产柚苷酶菌株,其中A09产酶最高,摇瓶产酶达263U／mL,初步确定为黑曲霉。研究发现菌株A09的产酶过程需要柚苷诱导,该菌株具有较好的选育潜力。     

响应面法优化乳杆菌发酵生产奶味香精的工艺研究

主要研究了利用响应面法优化保加利亚乳杆菌发酵生产奶味香精的工艺条件。选择底物浓度、菌种接种量、发酵温度、发酵时间为考察因素,利用Design-Expert软件进行设计和分析,确定了发酵产香的最佳工艺条件为:底物浓度21%、菌种接种量16%、发酵温度38℃、发酵时间21 h。     

汽爆玉米秸秆脱毒及发酵丁醇工艺的实验研究

研究了不同脱毒方法对汽爆玉米秸秆发酵产丁醇的影响及发酵工艺。实验共考查了十种不同的脱毒工艺路线,结果表明:汽爆玉米秸秆经水洗预处理脱毒后,经酶解、离心去除沉淀物,并补加营养物质是一条较佳的工艺路线。在此基础上,进一步利用单因素实验和正交实验,考察了发酵温度、pH值、接种量、菌种种龄、培养基组成、发酵时间对丁醇发酵的影响,得到较优的丁醇发酵工艺条件为,发酵温度37℃,pH7.0,接种量7%,菌种种龄27h,培养基组成:酵母抽提物1.0g·L-1、KH2PO40.8g·L-1、MgSO4·7H2O 0.1g·L-1、(NH4)2SO42.0 g·L-1、FeSO4.7H2O 0.03g·L-1、尿素2.0g·L-1,发酵时间48 h。在此优化条件下,发酵液中起始糖浓度为50g·L-1时,丁醇的发酵浓度达到了9.42g·L-1。     

蛋白酶生产菌的产酶条件研究

由南京紫光精细化工厂污水中筛得一株耐有机溶剂蛋白酶生产菌,经菌种鉴定,确认其为盐芽孢杆菌。对其进行了蛋白酶生产条件优化的研究,结果表明,该菌的最适产酶条件为:蛋白胨为最佳有机氮源,甘油为最佳有机碳源,硫酸铵为最佳无机氮源,氨基酸对蛋白酶的分泌有抑制作用,FeCl_2为最佳无机盐,最优pH=8.0,最优发酵温度37℃,最优发酵产酶时间72 h,最佳摇床转速180 r/min,在最优发酵条件下所产粗酶为3 424个酶活单位。     

降解秸秆的纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件研究

从土壤、霉变的农产品和实验室保存的真菌中筛选到15株产纤维素酶的菌株,其中绿色木霉T206产酶能力最强。利用液体发酵,研究了碳源、氮源、接种量、起始pH值、培养时间等对菌株产酶的影响,以及该菌株所产纤维素酶的种类。在最适条件下菌株培养96h后,羧甲基纤维素酶活(CMCA)最高达到7654.33U,是优化前酶活的1.7倍,滤纸酶活(FPA)达到1675.12U。     

柚苷酶的应用及发酵生产研究

介绍了柚苷酶的性质、应用,重点介绍了柚苷酶的发酵进展,包括柚苷酶生产菌的筛选方法及发酵条件等,并指出柚苷梅生产中存在的问题及对策。     

Pycnoporus sp.SYBC-L3种子培养对深层发酵产漆酶的影响

对Pycnoporus sp.SYBC-L3深层发酵产漆酶种子的培养及接种种龄进行了优化。结果表明,从平板直接接种菌丝片或者孢子悬液到发酵产酶培养基,生物量及漆酶活力都非常低;采取种子培养并接种发酵培养基可提高漆酶活力;该菌株在种子培养基中以菌丝球的形式生长,菌丝球的大小与接种量有关,接种量小,菌丝球就大,相反接种量大,菌丝球则小;从平板到种子培养基的转接过程中,以洗孢子的方式接种要略优于打孔的方式;在种子培养的过程中添加玻璃珠导致菌丝球严重破裂,生长减缓,不利于进一步深层发酵产漆酶;种子在不同的培养基中生长,以PDA培养基为最好;在以PDA为培养基时,接种量在10%是深层发酵产漆酶活力最高;种龄在第3天时为最好。经过种子培养的优化后,进一步深层发酵产漆酶活力提高了6倍。     

嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶高产菌株及其性质

从生物质资源丰富的武夷山中采样天然腐烂枯枝、烂叶、土壤等材料中分离筛选,采用对硝基酚-β-葡萄糖苷(pNPG)法对复筛菌株进行酶活测定,得到一株高产β-葡萄糖苷酶菌株,并对其酶学性质进行研究,结果表明:该酶的液体发酵最高酶活高达482.1U/mL,最适反应pH值为4.8,最适反应温度为65℃;乙醇浓度为10%对酶活有最大促进作用,对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍,乙醇耐受能力高达30%。将该酶应用于同步糖化发酵中,发酵至120h得乙醇最高产量,所产乙醇含量高达41.25g/L,与阴性、阳性对照相比,乙醇产量提高近2倍。该菌株所产的β-葡萄糖苷酶酶活力较高,应用于同步糖化发酵过程具有明显的促进效果,对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。     

响应面法优化壳聚糖酶产生菌Mitsuaria sp.K1的产酶发酵条件

壳聚糖（chitosan）及其降解产物因具有优良的物理特性和生物活性而被广泛关注。通过平板透明圈初筛、摇瓶复筛方法,从青岛海岸土壤中分离筛选到1株产壳聚糖酶活性较高的细菌Mitsuaria sp.K1,并对其产酶发酵条件进行了单因素试验和响应面优化分析试验。结果表明：在最适培养基组成（1%粉末壳聚糖、0.5%硝酸钾、0.22%KH2PO4、0.1%Na2HPO4、0.15%KCl、0.05%MgSO4?7H2O）和最佳培养条件（培养温度25.2 ℃,培养时间25.4 h,起始pH值6.5,接种量3%,装液量100 mL/500 mL摇瓶,160 r/min）下,Mitsuaria sp.K1的发酵粗酶液最高酶活平均达11.56 U/mL,比优化前的2.17 U/mL提高了4.32倍。与前人研究结果相比,该菌发酵产酶温度降低了5～10 ℃,产酶周期缩短了23～47 h,因此具有工业发酵应用价值。     

有机酸Fe2+与无机酸Fe2+驯化的保加利亚乳杆菌发酵特性的比较分析

保加利亚乳杆菌是酸奶发酵剂中常用的菌种,对酸奶的黏度、酸度、发酵时间及酸奶中活菌数有重大影响。为进一步得到铁强化酸奶优良菌株,本文对有机酸Fe²⁺(富马酸亚铁、柠檬酸亚铁与柠檬酸铁铵)与无机酸Fe²⁺(硫酸亚铁)分别驯化传代培养的保加利亚乳杆菌发酵特性进行了对比。结果表明,在酸奶接种6%富马酸亚铁驯化传代的保加利亚乳杆菌种子液时,酸奶发酵时间最短,产酸和产黏能力最强,酸奶活菌数最高,发酵活力最强。本研究为酸奶的铁强化及发酵剂优化选择提供了参考。     

高产酸性普鲁兰酶工程菌株种子强化工艺

为进一步提高酸性普鲁兰酶工程菌株(Baclicus subtilis F1147)的产酶水平,开展了工程菌株种子强化工艺的研究。采用小米为载体,制备菌株接触面大、通气量好的小米种培养基,小米种摇瓶发酵最佳接种量为0.33%,其发酵酶活较二代斜面种高64.5%,较摇瓶种高21.4%。30 L罐补料分批发酵,小米种最佳接种量为0.33%,种子罐周期约为8 h,较摇瓶种种子罐提前1 h,发酵最高酶活达1 209 U/m L,较摇瓶种罐高73.7%,生长及产酶周期较摇瓶种罐延长4 h,最高菌浓也较摇瓶种罐高出22.1%,显著促进菌株生长及延长产酶周期。并且小米种发酵有利于改善发酵液特性,提高陶瓷膜除菌效率,其除菌率达100%,滤液浓缩4倍,酶活力回收率可达90.4%,体现了较好的浓缩效果,为工程菌株的工业化放大应用奠定了良好基础。     

发酵罐法培养疣孢漆斑菌产漆酶培养条件的研究

提高疣孢漆斑菌的漆酶产量,并且降低成本,使其得到大规模的应用,还要依赖于成熟的工业化发酵技术,因此实验选用16L全自动不锈钢发酵罐对疣孢漆斑菌菌种进行发酵培养,主要通过对不同通气量、搅拌速率和补加营养物质来研究疣孢漆斑菌发酵罐培养产漆酶的培养条件,以提高菌种漆酶产量。结果表明,通气量为1.0vvm时适于疣孢漆斑菌产漆酶,并且不会对设备产生过高的损耗;搅拌器转速为150r/min时,可以有效提高发酵液溶氧量,控制菌种生长,提高产酶活力;补加营养物质的研究显示,虽然没有达到预期的使产酶量出现二次高峰的效果,但补加营养物质可以延长菌种生长时间。     

硫酸铵盐析法提高β-葡萄糖苷酶活探究实验

对由前期筛选出的目的菌种所产β-葡萄糖苷酶利用硫酸铵盐析法提高其酶活,探究硫酸铵饱和度,盐析pH值和静置时间对提高β-葡萄糖苷酶活效果影响。当盐析条件为:硫酸铵饱和度60%,盐析pH值5.5,静置时间12h时,可使β-葡萄糖苷酶活从初始的0.72U/ml提高至1.03U/ml。     

-乳酸的研究

从所选取的产l-乳酸的4株菌中筛选出一株性能优良、糖利用率和乳酸产量较高的菌种作为试验用菌种。对影响乳酸菌发酵大豆秸秆酶解物制备l-乳酸的因素进行了研究,影响大豆秸秆酶解液发酵的主要因素是菌种类型、底物糖浓度、接种量、温度及pH值。结果表明:干酪乳酸菌是较适宜的发酵菌种,较适宜的发酵条件为:发酵温度30℃,接种量10%,pH值5.5。随着底物糖含量的增加,乳酸产率相应增大,在实验范围内,乳酸菌发酵所产乳酸的产率达到80%。