代谢工程改造蛋氨酸代谢途径构建高产L-蛋氨酸大肠杆菌

以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株,敲除其蛋氨酸合成途径中关键酶的阻遏基因metJ,使菌株积累蛋氨酸达22 mg/L. 在此基础上,利用紫外诱变筛选育出一株抗蛋氨酸结构类似物的蛋氨酸高产菌株YB12,使蛋氨酸产量提高到60 mg/L. 通过过量表达蛋氨酸合成途径中的metA和cysE基因及编码蛋氨酸转运蛋白的yeaS基因,YB12菌株积累蛋氨酸量提高到251 mg/L. 结果表明,蛋氨酸在胞外的积累受多个基因、多种代谢途径调控,单独敲除某个基因或改造某个途径不能使蛋氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建蛋氨酸工程菌的最有效方法.     

溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其代谢流迁移的影响

为有效降低L-苏氨酸发酵过程中副产物的积累,考察了发酵过程中的溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其多种副产物积累的影响,并深入探讨了振荡行为对L-苏氨酸生物合成代谢网络的代谢流分布的影响。结果表明:采用溶氧强制振荡工艺能够明显提高L-苏氨酸的发酵产率和降低多种抑制性产物的合成。与非振荡工艺相比,经过36h培养,细胞生物量达到29.5g·L-1,苏氨酸的质量浓度达到118.9g·L-1,而乙酸质量浓度下降到0.8g·L-1,副产的其他氨基酸也大大降低。通过代谢流分析表明,在发酵后期的一个振荡周期(30h至31h)内,与非振荡组相比,HMP途径的代谢流量由6.5提高至95.88,CO2固定反应代谢流量由45.1提高至86.1,TCA循环相对代谢流量从1.86提高至17.78,从而导致苏氨酸对葡萄糖的质量转化率从30.0%增加至57.0%。溶氧强制振荡条件下的苏氨酸发酵液中各种副产物更少,更适合今后的大规模工业化生产。     

重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butantriol,BT)属于非天然化学品,是军工材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯的前体。在重组大肠杆菌中,木糖经脱氢、脱水、脱羧和还原合成BT。但途径各反应不平衡使得中间代谢物积累限制菌体生长和产物合成。本研究首先通过CRISPR/Cas9敲除基因yjh G和yqh D构建无本底表达宿主菌,随后利用不同启动子组合调节BT合成途径中基因xdh、yjh G和yqh D的表达。结果发现,以P_inv表达醇脱氢酶基因yqh D使BT产量达到14.4g/L;以P_tac表达脱氢酶基因xdh和P_{rrn HP1}表达脱水酶基因yjh G的组合方式,BT产量达到15.6g/L,比对照菌株KXW3009分别增加5.9%和14.7%。本研究通过对中间代谢物木糖酸合成和代谢的组合优化,促进了BT的合成,为后续研究提供了借鉴。     

微生物合成2,3-丁二醇的代谢工程

2,3-丁二醇(2,3-BD)是一种重要的微生物代谢产物,广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。微生物合成2,3-BD的效率不高一直制约着其生物制造工业化进程,应用代谢工程的理论和方法优化微生物的代谢途径有望解决这一问题。本文全面总结了近年来微生物合成2,3-BD研究过程中的菌株改造和构建技术,包括过表达合成途径中的关键酶编码基因、敲除旁路代谢途径关键酶编码基因、应用辅因子工程手段对天然菌株代谢网络进行重新设计和合理改造,以及利用合成生物学技术在模式菌株中构建全新的代谢途径,实现2,3-BD的高效生物合成。最后,本文对未来的研究方向进行了展望,提出了进一步利用先进的合成生物学方法构建高效细胞工厂的指导性建议。     

肺炎克雷伯氏菌生物合成1,3-丙二醇的副产物调控研究

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955为原始菌株,利用代谢工程手段对K.pneumoniae生物合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的副产物进行调控.通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到83.8 g·L-1,生产强度提至2.79 g...     

基因敲除弱化产1,3-丙二醇Klebsiella pneumoniae荚膜多糖的合成

1,3-丙二醇(1,3-PDO)是重要的平台化合物,在高性能纤维合成等领域具有广泛应用。Klebsiella pneumoniae是优良的1,3-PDO生物合成细胞工厂,但该菌代谢甘油合成1,3-PDO时积累大量荚膜多糖,影响底物与产物的高效转运,导致发酵液黏度增大,限制发酵法生产1,3-丙二醇的下游提取及产业化。本研究基于已报道的K.pneumoniae荚膜合成途径,利用Red重组技术对K.pneumoniae荚膜多糖合成途径中的起始糖基转移酶wec A基因及参与荚膜多糖后期组装的跨膜蛋白wzi基因进行敲除,并考察上述基因缺失对菌株荚膜含量、细胞形态、菌体生长、发酵液黏度及产物合成的影响。研究发现,同时缺失wec A和wzi基因对于弱化荚膜多糖效果显著,荚膜含量降低38.5%,细胞基本丧失菌毛合成及相互粘连能力,1,3-PDO产量提高23.0%,为菌株改造提供了一种新思路。     

基于关键节点代谢流重排提高酿酒酵母的香叶基香叶醇产量

香叶基香叶醇(geranylgeraniol,GGOH)是生产香料、药物、维生素A和E的重要中间体,其生物活性构型为(E,E,E)-GGOH。为了提高酿酒酵母的(E,E,E)-GGOH产量,在表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶-法尼基焦磷酸合酶融合酶(BTS1-DPP1)和香叶基香叶基焦磷酸合酶-二酰基甘油二磷酸磷酸酶融合酶(BTS1-ERG20)的初始菌株(产34.85mg?L~(-1)GGOH)的基础上,本实验进一步利用代谢工程的手段对法尼基焦磷酸(FPP)代谢节点处进行代谢流重排。一方面,过表达了来源于红法夫酵母的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶突变体(Crt E03M),增加了前体物质GGPP的供应,从而将GGOH产量提高了1.6倍,达到56.04mg?L~(-1);另一方面,利用葡萄糖诱导性弱启动子PHXT1对竞争支路关键酶角鲨烯合酶(ERG9)进行下调,从而使GGOH产量提高4.5倍,达到156mg?L~(-1)。同时,通过敲除GAL80基因构建了葡萄糖调控的GAL体系,用以控制GGOH的合成,与PHXT1控制的角鲨烯合成支路一起,构成了顺序表达体系,最终,以十二烷为有机相,在摇瓶中进行两相发酵,培养72 h后获得GGOH产量183.07mg?L~(-1),与初始菌株相比提高了5倍。本工作对其他FPP下游途径的代谢调控具有借鉴意义。     

微生物合成2,3-丁二醇的代谢工程

2,3-丁二醇（2,3-BD）是一种重要的微生物代谢产物,广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。微生物合成2,3-BD的效率不高一直制约着其生物制造工业化进程,应用代谢工程的理论和方法优化微生物的代谢途径有望解决这一问题。本文全面总结了近年来微生物合成2,3-BD研究过程中的菌株改造和构建技术,包括过表达合成途径中的关键酶编码基因、敲除旁路代谢途径关键酶编码基因、应用辅因子工程手段对天然菌株代谢网络进行重新设计和合理改造,以及利用合成生物学技术在模式菌株中构建全新的代谢途径,实现2,3-BD的高效生物合成。最后,本文对未来的研究方向进行了展望,提出了进一步利用先进的合成生物学方法构建高效细胞工厂的指导性建议。     

重组大肠杆菌利用D-木糖合成D-1,2,4-丁三醇

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol, BT)是一种重要的有机合成中间体。通过克隆表达恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida ATCC12633)2-酮酸脱羧酶(mdlC)和新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)D-木糖脱氢酶(xdh),敲除木糖利用和D-1,2,4-丁三醇合成中间代谢物分解途径中关键基因木糖异构酶(xylA)和2-酮酸醛缩酶(yjhH和yagE),重构大肠杆菌代谢网络,得到了能够将D-木糖转化为D-1,2,4-丁三醇的重组菌株。考察了温度、装液量、pH控制等条件对重组菌株合成D-1,2,4-丁三醇的影响,在适宜条件下发酵36 h后D-1,2,4-丁三醇产量达到3.96 g·L^-1。探讨了葡萄糖利用与丁三醇合成的关系,通过敲除编码酶IICB^Glc的ptsG基因改造重组菌株的磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶(phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system, PTS)系统,菌株可以在利用葡萄糖生长的同时进行木糖的转化,具有更高的合成能力。     

高效液相色谱法分析N-月桂酰基苏氨酸

采用两相滴定法对N-月桂酰基苏氨酸(C_(12)Thr)进行纯度分析时,发现有严重的乳化现象,对滴定终点判断产生明显干扰。为解决这一问题,建立了高效液相色谱法分析C_(12)Thr。采用示差折光检测器检测,以Hedera ODS-2 C_(18)反相柱(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱、甲醇为流动相(流速为0.6 mL·min~(-1)),进样量为40μL,柱温35℃。结果表明:C_(12)Thr在质量浓度6.07×10~(-2)～1.62 g·L~(-1)范围内时,色谱流出曲线峰面积(A)与C_(12)Thr浓度(c, g·L~(-1))之间存在良好的线性关系:A=2.41×10~5 c+1.98×10~3 (R~2=0.9985),检测限为4.12×10~(-3) g·L~(-1),加标回收率为(99.55±0.18)%;同时,该分析条件对未反应的原料月桂酸(LA)也有很好的分析效果,LA和C_(12)Thr彼此间能够实现基线分离,LA浓度在6.49×10~(-3)～8.64×10~(-2) g·L~(-1)范围内存在良好的线性关系:A=2.14×10~5 c+4.43×10~2 (R~2=0.9993),检测限为4.32×10~(-3) g·L~(-1),加标回收率(99.47±0.16)%。     

海洋放线菌S187产抗补体活性物质的发酵工艺优化

海洋放线菌S187的代谢产物具有较好的抗补体活性。以抗补体活性为评价指标,在单因素实验的基础上,采用正交实验优化菌株S187产抗补体活性物质的发酵工艺。确定最佳发酵工艺为:可溶性淀粉20 g·L~(-1),大豆粉35 g·L~(-1),(NH_4)_2SO_4 2 g·L~(-1),NaCl 2 g·L~(-1),K_2HPO_4 0.5 g·L~(-1),CaCO_3 5 g·L~(-1),初始pH值7.5,于28℃、220 r·min~(-1)下发酵7 d。在此条件下,菌株S187代谢产物的抗补体活性为69.35%。     

基于离子液体型表面活性剂的胶束电动毛细管色谱法分析苏氨酸

利用溴化-1-十二烷基-3-甲基咪唑为胶束电动毛细管色谱的假固定相,建立了对苏氨酸进行测定的方法。详细考察了缓冲溶液pH值及浓度、离子液体型表面活性剂的种类及用量、分离高压、进样条件等因素。最优实验条件如下:以未涂层弹性石英毛细管(55 cm×75μm)为分离通道,25 mmol·L~(-1)的表面活性剂+20 mmol·L~(-1)磷酸盐缓冲溶液(pH=8.0)为运行缓冲溶液,运行高压-25 kV,柱温为23℃,压力进样50 mmbar×40 s。对苏氨酸检测的线性范围为0.01~2 mg·mL~(-1),检出限为5 mg·L~(-1)。结果表明,该方法简单、分析速度快,重现性好。     

低渗透油藏内源微生物激活剂及激活产物研究

以大庆朝阳沟低渗透油田88-122井为研究对象,通过高通量测序技术对其内源微生物群落及地层水离子组成进行了分析;以菌体浓度和表面张力为考核指标,获得了内源微生物激活剂配方;并分析了油藏内源微生物激活后的产物成分及群落变化。结果表明,低渗透内源微生物激活剂配方为:糖蜜6.0 g·L~(-1)、NaNO_3 9.0 g·L~(-1)、(NH_4)_2HPO_4 1.67 g·L~(-1)、FeSO_4·7H_2O 0.02 g·L~(-1)、MgSO_4 0.1 g·L~(-1)、MnSO_4·H_2O 0.000 5 g·L~(-1),培养时间为4 d,激活后菌体浓度达到1.2×10~9 CFU·mL~(-1),表面张力可降至45.75 mN·m~(-1);激活后内源微生物所产生物气主要为CO_2和H_2,为产甲烷菌提供了充足的底物;挥发性脂肪酸以乙酸含量最高,达1 078.38 mg·L~(-1)。该激活剂不但能激活地层水中的采油功能菌群,而且最大限度地降低了表面张力,同时,抑制了有害菌群的生长,具有提高原油采收率的潜力。     

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化

选用玉米粉、豆饼粉、KH_2PO_4及Na_2HPO_4为基础配方,通过单因素实验对枯草芽孢杆菌发酵产中性蛋白酶的发酵培养基、培养条件、发酵条件进行优化。确定了优化的发酵培养基为:20g·L~(-1)甘油,30g·L~(-1)豆饼粉,2mmol·L~(-1)氯化钙,0.3g·L~(-1 )KH_2PO_4,4g·L~(-1 )Na_2HPO_4;优化的培养条件为:培养温度30℃,接种量5%。调控发酵培养基pH值7.0控制发酵,发酵24h酶活达到7 344U·mL~(-1)。进行流加甘油实验,培养温度30℃,发酵过程控制pH值7.0,调整转速和通风量控制溶氧30%～35%,接种量5%,经过30h发酵,酶活达到10 654U·mL~(-1),较未补料提高了45%。     

重组大肠杆菌HW2利用甘油高产1,2-丙二醇的研究

对一株能在厌氧条件下高效代谢甘油的大肠杆菌突变株HW2进行基因工程改造,使其能利用甘油合成1,2-丙二醇。首先,敲除HW2中与丙酮醛脱毒途径相关的三个基因ald A、glo A、hch A和乳酸合成基因ldh A,得到菌株HWAGHL,并在甘油培养基I中厌氧培养。结果显示菌株HWAGHL代谢甘油的能力并没有明显减弱,培养120 h后能产0.013 g?L?1的1,2-丙二醇。在HWAGHL中单独过表达mgs A后,经72 h厌氧培养可得0.04 g?L?1的1,2-丙二醇,在HWAGHL中共表达gld A、dha KL(来自弗氏柠檬杆菌)、mgs A和yqh D(HWAGHL/p TH)后,经72 h厌氧培养可得0.48g?L?1的1,2-丙二醇。在菌株HWAGHL/p TH中过表达gld A和fuc O,1,2-丙二醇产量可分别提高18%和16%。最后,菌株HWAGHL/p TH在甘油培养基II中厌氧培养,72 h可得1.58 g?L?1的1,2-丙二醇,得率为0.20 g?g?1甘油。     

Ni-Co-B合金电镀工艺优化及镀层耐蚀性研究

采用复合电镀工艺在碳钢试片表面制备了耐蚀性优良的Ni-Co-B合金镀层,通过正交试验对电镀工艺条件进行优化,得到的最佳合金电镀工艺为:硫酸镍180 g·L~(-1)、硫酸钴60 g·L~(-1)、四硼酸钠3 g·L~(-1)、硼酸30 g·L~(-1)、氯化铵25 g·L~(-1)、十二烷基硫酸钠3 g·L~(-1)、糖精钠2 g·L~(-1)、温度50℃、p H为5.0、电流密度8 A·dm~(-2)、时间40 min。在最佳工艺条件下,所得的Ni-Co-B合金镀层的耐蚀性优于工艺优化前的镀层。     

不同碳源及通气条件下lpdA基因敲除对大肠杆菌代谢的影响

lpdA基因编码的lipoamide dehydrogenase是丙酮酸脱氢酶复合体、α-酮戊二酸脱氢酶复合体和甘氨酸裂解多酶体系的组成亚基之一.比较了不同碳源及通气条件下,lpdA基因敲除突变E. coli与野生E. coli的发酵特性,并通过对一些主要的酶活和胞内代谢产物浓度的测量,考察了lpdA基因敲除对E. coli代谢的影响.结果表明：葡萄糖为碳源的有氧条件下,lpdA基因的敲除导致丙酮酸、D-乳酸、L-谷氨酸的积累,TCA循环的抑制,乙醛酸途径和磷酸戊糖途径中的磷酸葡萄糖脱氢酶的激活.乙酸或丙酮酸为碳源的有氧发酵及葡萄糖为碳源的微氧发酵实验补充了以上的结论.     

适用高铬合金石油管箍的锰系磷化液的开发研究

将钼酸铵、硫酸铜、1,10-二氮菲配入普通的锰系磷化液中,通过试验优化了配方:马日夫盐27g·L~(-1)、磷酸7.5 g·L~(-1)、硝酸锰15 g·L~(-1)、硫酸铜0.3 g·L~(-1)、钼酸铵0.4 g·L~(-1)、1,10-二氮菲1.0 g·L~(-1)。优化后的磷化液应用在高铬合金石油管箍的高温锰系磷化中,与普通锰系磷化液相比,磷化时间缩短,磷化膜厚度增加,磷化膜的耐磨性也得到提高。     

醛脱氢酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇的影响

利用Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇时，一部分甘油通过氧化代谢途径大量合成副产物乙醇，降低了1,3-丙二醇的得率.醛脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为NAD⁺，降低了同为NADH依赖型的1,3-PD合成途径的效率.本文以醛脱氢酶ALDH为改造目标，以K.pneumoniae为宿主，通过同源重组技术在K.pneumoniae M5aL的ALDH基因中成功地插入了四环素抗性基因，经抗性筛选和基因水平鉴定，得到两株ALDH基因敲除的重组菌0623-1hb及0623-1hc.本文研究了这两株重组菌的生长代谢特性，结果表明两株重组菌的ALDH酶活基本检测不到，菌体生长受到明显抑制，乙醇合成浓度比出发菌株K.pneumoniae M5aL降低了43%～53%，1,3-PD合成浓度及摩尔得率分别提高了27%～42%和19%～24%.     

利用餐厨垃圾渗滤液培养苏云金芽孢杆菌

以餐厨垃圾渗滤液为培养基,研究了苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的培养条件及其去除餐厨垃圾渗滤液中主要营养成分的优化控制条件。结果表明,当餐厨垃圾渗滤液体积分数在25%~100%范围内时,随餐厨垃圾渗滤液体积分数的增大,Bt生物量增大,Bt菌落形成单位升高,72h达到4.5×107 CFU·mL~(-1),对餐厨垃圾渗滤液中总有机碳(TOC)和总氮(TN)的去除率分别达到48.8%和52.4%。在餐厨垃圾渗滤液中添加1g·L~(-1) KH_2PO_4和1g·L~(-1) MgSO_4分别作为磷源和硫源,可以促进Bt的生长,72h菌落形成单位达到1.4×108 CFU·mL~(-1)。表明利用餐厨垃圾渗滤液可以高效培养生物农药Bt,是废弃物高效资源化利用的有效途径,具有重要的应用价值。