SM_2人工抗原合成研究

采用重氮化法合成磺胺二甲嘧啶(SM2)-人血清白蛋白(HAS)免疫抗原和SM2-卵清白蛋白(OVA)包被抗原。经紫外光谱扫描法确认SM2与载体蛋白偶联成功;经计算得SM2与HSA、OVA的结合比分别为9:1和15:1。     

基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法的建立

为建立一种简便、快速、准确的双酚A检测方法,采用活性酯法将双酚酸与牛血清蛋白、卵清蛋白偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠。选择抗血清效价和灵敏度高的BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法制备杂交瘤细胞,获得一株可分泌双酚A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过方阵滴定和反应条件优化,建立一种基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法。该检测方法在0.5 ng/mL～50 ng/mL内有良好的线性关系,最低检测限IC10为0.5 ng/mL,半数抑制率IC50为16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%～105.25%。该单克隆抗体效价高、特异性强,该检测方法灵敏度高。     

地西泮单克隆抗体的制备及其酶联 免疫吸附检测方法的建立

目的 制备地西泮(Diazepam DZP)单克隆抗体,并且对制备的抗体进行一系列性质鉴定。方法 利用EDC法合成免疫原和包被原,用免疫原免疫Balb/C小鼠,当效价到1:16000以后取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合。然后采用竞争结合双阳性两步筛选法,筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并且利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞,采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。接着利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化,利用酶联免疫吸附,SPR等方法对纯化后的抗体进行性质鉴定。结果 成功合成了地西泮免疫原和包被原,免疫Balb/C小鼠7次后效价达到1:16000,最终制备出单克隆抗体,抗体解离常数(KDs)为4.0985×10_-7M,且与大部分结构类似物没有明显的交叉反应。应用此抗体建立间接竞争ELISA法,抗体的IC₅₀=10.8ng/mL,检测范围为0.45ng/mL-862ng/mL。结论 制备出了地西泮单克隆抗体,为地西泮的免疫学检测提供了有力的支持。     

环丙沙星单克隆抗体的制备及鉴定

通过改进的碳二亚胺法制备环丙沙星- 牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA),用紫外扫描、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法鉴定偶联物。利用制备的CIP-BSA 偶联物作为免疫原,免疫Balb/c 小鼠,用杂交瘤技术制备环丙沙星单克隆抗体,并对其效价、亲和力和特异性进行鉴定。结果表明：CIP-BSA 的偶联比为30:1。经间接酶联免疫吸附(ELISA)法筛选,共筛出两株敏感、特异的杂交瘤细胞(JY-1、JY-2)。这两株细胞的腹水经纯化后的抗体效价分别为5.12 × 106、2.56 × 106,亲和力常数分别为2.88 × 109、2.46 × 109L/mol,两抗体均为IgG1a,取亲和力高的JY-1 进行竞争抑制测定,IC50 值可以达到9.83ng/mL。该单抗仅与恩诺沙星存在交叉反应,交叉反应率为95%。通过验证得到的JY-1 细胞株分泌的单克隆抗体可用于水产品中环丙沙星残留的快速检测。     

地西泮单克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附检测方法的建立

目的制备地西泮(diazepam,DZP)单克隆抗体,并且对制备的抗体进行一系列性质鉴定。方法利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodi imide hydrochloride,EDC·HCl]法合成免疫原和包被原,用免疫原免疫Balb/C小鼠,当效价到1:16000以后取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合。然后采用竞争结合双阳性两步筛选法,筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并且利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞,采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化,利用酶联免疫吸附法、表面等离子共振仪(surface plasmon resonance,SPR)等方法对纯化后的抗体进行性质鉴定。结果成功合成了地西泮免疫原和包被原,免疫Balb/C小鼠7次后效价达到1:16000,最终制备出单克隆抗体,抗体解离常数(dissociation constants,KDs)为4.0985×10-7 mol/L,且与大部分结构类似物没有明显的交叉反应。应用此抗体建立间接竞争ELISA法,抗体的IC50=10.8 ng/mL,检测范围为0.45~862.00 ng/mL。结论本研究制备出了地西泮单克隆抗体,为地西泮的免疫学检测提供了有力的支持。     

重金属铜的单抗的制备及免疫学检测方法的建立

目的:制备针对重金属铜离子的单克隆抗体,建立Cu2+的间接和直接竞争ELISA检测法,实现对Cu2+的快速定量测定。方法:利用双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA将Cu2+分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,制备免疫原和检测原;用免疫原免疫Balb/c小鼠;细胞融合后,通过间接及间接竞争ELISA筛选稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;制备腹水型单抗并进行鉴定;建立间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。结果:成功筛选出4株稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中G8制备出腹水型单抗效价为5×105倍,抗体亚型为Ig G1型,轻链类型为κ型,特异性检测结果表明该单抗对NOTA及Mn2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+等其金属离子交叉反应率远低于2%,与Mg2+交叉反应率小于8%,表明单克隆抗体G8对重金属Cu2+具有很强的特异性,不会干扰结果的准确性;建立间接竞争ELISA的检测灵敏度为29.8 ng/m L,检测限为2.4 ng/m L,线性范围为4.5~196.7 ng/m L;直接竞争ELISA检测法的检测灵敏度为12.89 ng/m L,检测限为0.88 ng/m L,检测范围为1.72~96.58 ng/m L。结论:成功制备出抗重金属铜离子的单克隆抗体,并建立了间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。     

畜产品中磺胺药物残留的检测研究

建立了检测畜产品中磺胺二甲嘧啶 SM2 的间接竞争酶联免疫反应吸附法 (EL ISA)。以 SM2 、丁二酸酐 (SA)再加上牛血清白蛋白 (BSA)或卵白蛋白 (OA)的结合物免疫小鼠 ,制备特异性针对 SM2 的多克隆抗体。畜产品试样经提取后用 ELISA检测。测定浓度范围 2 .0～ 1 2 0 ng/ ml,最小检测限 2 .0 ng/ ml。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

制备抗沙丁胺醇单克隆抗体,鉴定其特异性并建立间接竞争ELISA检测方法.以合成的沙丁胺醇完全抗原免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选克隆得到稳定分泌抗沙丁胺醇抗体的单克隆杂交瘤细胞,命名为4E4和3A2.经鉴定,两个抗体亚类都为IgG,,其腹水纯化后效价分别达到2.56 ×105和1.28 ×105.以效价高且特异性较好的4E4细胞株获得的抗体建立间接竞争ELISA方法,经条件优化后得到标准曲线,检测范围为4.76～84.99ng/mL,IC50为20.12ng/mL,检测限为3.25ng/mL,与克伦特罗交叉反应率为253.62%,与其它结构类似物没有明显交叉反应.本研究制备的单克隆抗体和建立的间接ELISA方法,可用于开发同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的试剂盒.     

沙丁胺醇铕标记时间分辨荧光免疫分析方法的建立

基于抗沙丁胺醇(SAL)的单克隆抗体,初步建立了检测SAL的高灵敏度的时间分辨直接竞争免疫分析法(CDTRFIA)。采用辛酸-硫酸铵纯化抗SAL杂交瘤细胞株腹水单克隆抗体,用稀土离子Eu3+偶联物进行标记,制备铕标抗体;通过合成SAL-SUC半抗原并与卵清蛋白偶联获得SAL-OVA包被抗原:采用直接竞争的方式,游离SAL和固相SAL-OVA包被原共同竞争有限的铕标SAL单抗,初步建立SAL时间分辨免疫分析方法。研究发现,优化的TRFIA半抑制量IC_(50)为1.6 ng/mL,检测范围为0.39 ng/m L~12.77 ng/mL,最低检测限为0.136 ng/mL。通过对其他常用β-兴奋剂进行交叉反应分析,研究发现建立的TRFIA方法特异选择性高,与克伦特罗的交叉率较小(2.29%),而与莱克多巴胺没有交叉。     

大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

为制备免疫学特性良好的大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypsin inhibitor,KTI)单克隆抗体,以50μg/只的免疫剂量将KTI免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和敏感性,选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到稳定分泌KTI单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度(IC50)为157.33ng/mL,经细胞融合筛选得到4E6-E9阳性杂交瘤细胞株,所制备的抗体效价达到11 638 400,亚型为IgG1型,亲和常数为1.45×108 L/mol,IC50为28.39ng/mL,且特异性强。说明试验所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立灵敏、特异的KTI免疫学检测方法提供良好的抗体保障。     

异丙威单克隆抗体的制备及鉴定

异丙威是我国农业生产中常见的杀虫剂,在果蔬、粮食和烟草等中都有广泛应用,然而这类农药也具有较强生物毒性。为了制备异丙威单克隆抗体,以实现对农药异丙威药物的快速检测。本文以2-异丙基苯酚等为原料,合成异丙威半抗原及人工抗原,并通过免疫小鼠、细胞融合、克隆、筛选获得单克隆抗体细胞株,经腹水诱导法及辛酸-硫酸铵沉淀法制得异丙威单克隆抗体,通过间接竞争ELISA法对抗体的特异性进行鉴定。结果表明,制备的异丙威单克隆抗体检测范围为1.88~82.80 ng/m L,抗体的IC50为11.70ng/m L,最低检测限为0.54 ng/m L,抗体与克百威、西维因、涕灭威、灭多威、2-异丙基苯酚5种异丙威结构类似物均无明显交叉反应,具有高特异性,能够满足农产品中异丙威残留检测的要求。异丙威单克隆抗体的制备为异丙威快速检测产品的开发奠定了基础。     

定量检测转基因植物蛋白Cry1Ac的双抗体夹心ELISA方法建立

以典型且研究较多的抗虫CrylAc基因表达的CrylAc蛋白为检测目标,制备其单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体,在优化抗体纯化方案,获得纯化抗体的基础上,以CrylAc单克隆抗体为包被抗体,以辣根过氧化物酶标记的CrylAb单克隆抗体为检测抗体,建立了CrylAc蛋白的双抗体夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)检测法,并用于玉米中CrylAc蛋白含量的检测。结果显示,所建立的双抗体夹心ELISA法稳定性较好,测定变异系数在3%以内;在10 ng/mL~200 ng/mL的浓度范围内,线性回归方程为+=0768.0x0114.0y(R2=0.9989),检测限为9.49 ng/mL;对玉米样品提取液中Cry1Ac蛋白含量的测定回收率在102.5%~103%范围内。本研究所建立的双抗体夹心ELISA法为玉米中Cry1Ac蛋白的定量检测提供了有效的手段,可作为一种潜在的检测方法用于转基因产品的检验检疫中,在出入境检验检疫工作中也有较高的应用价值。     

Purification of alginate and feasible production of monoclonal antibodies by the alginate-immobilized hybridoma cells

Alginate has an extensive usage in the immobilization of many cell types. Although they have high biocompatibility, commercial alginates contain various degrees of contaminants such as polyphenols, endotoxins and proteins. Thus, these alginates show cytotoxicity against sensitive cell types such as hybridoma cells. In the studies so far, owing to this fact, commercially purchased high-priced ultrapure alginates have been used in the immobilization of hybridoma cells for monoclonal antibody production. However in this study, as a novelty, low-priced commercial alginate was purified, and then the cultivation of alginate-immobilized hybridoma cells was performed for feasible monoclonal antibody production. Low-priced commercial alginate was purified with a profitability ratio of 40%. Then, an optimized immobilization procedure was conducted effectively by using the purified alginate. During more than 25 days of cultivation, serum concentration was kept low, and approximately 2 times greater monoclonal antibody production was achieved, in comparison with its free suspended counterpart. The results showed that the efficiency of monoclonal antibody production via alginate-immobilized hybridoma cultivation can be increased by performing a proved in-house purification method. By shedding light on the efficiency of the in-house purification method, the results also indicated a feasible way of monoclonal antibody production.     

高有机溶剂耐受性的苯并(a)芘单克隆抗体制备及其免疫反应特性研究

目的 制备适应油脂样品中苯并(a)芘[Benzo(a)pyrene,BaP]检测需求的抗BaP单克隆抗体。方法 利用杂交瘤单克隆抗体技术制备抗BaP的抗体,在抗体筛选过程中使用高浓度的有机溶剂(50%甲醇)来选择具有较高有机溶剂耐受能力的抗体,并利用间接竞争酶联免疫吸附法考察了抗体的免疫反应特性。结果 筛选获得一株对有机溶剂有较高耐受能力的、稳定分泌BaP单克隆抗体的细胞株2H10,该抗体为IgG1亚型,可耐受高浓度的甲醇、丙酮、二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和二甲基甲酰胺(Dimethylformamide,DMF)。60%甲醇和60% DMSO作为样品稀释液时,抗体对BaP的IC₅₀分别为81.4和24.5 ng/mL,以60% DMSO作为样品稀释液,可以显著降低BaP抗体对其它多环芳烃化合物的交叉反应率。结论 本研究获得高特异性的BaP人工抗原及高有机溶剂耐受性的抗BaP单克隆抗体。     

同时检测恩诺沙星和环丙沙星单克隆抗体的制备

为了产生同时检测恩诺沙星和环丙沙星的抗体,本研究采用戊二醛法制备突出恩诺沙星和环丙沙星共同结构的人工抗原。免疫Balb/c 小鼠的结果显示：使用糖基化载体所制备的免疫抗原,能够大幅提高所产生特异性抗体的滴度。通过细胞融合,筛选出一株对恩诺沙星和环丙沙星IC50 值分别为9.6ng/mL 和10.2ng/mL 的单克隆抗体。     

赭曲霉毒素A单克隆抗体的体外制备及其重组抗体的构建研究

目的 实现抗赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)单克隆抗体的体外制备及其重组抗体表达载体的构建与瞬时转染表达。方法 以前期获得的OTA杂交瘤细胞株(O16)为研究对象,通过无血清驯化培养的方式开展OTA单克隆抗体的体外制备研究;采用简并引物法获取OTA杂交瘤细胞的单克隆抗体编码基因,在此基础上构建OTA重组全长抗体表达载体以及OTA重、轻链可变区基因片段与人源恒定区片段连接的重组嵌合抗体表达载体,并基于哺乳动物细胞系,开展两种重组抗体的瞬时转染表达研究。结果 通过缓降血清浓度的方式对OTA杂交瘤细胞进行无血清驯化,实现了体外培养制备OTA单克隆抗体;在此基础上测得OTA单克隆抗体的重链和轻链基因序列,并成功构建了OTA重组全长抗体表达载体(pCDNA3.4-OTA-H/L)和重组嵌合抗体表达载体(p FUSE-OTA-H/L),通过共转染实现了两者在哺乳动物细胞系中的瞬时转染表达;经间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)确定体外培养制备的OTA抗体、OTA重组全长抗体和嵌合抗体均具备特异性结合抗原的能力,三者的...     

表面等离子体共振生物芯片无标记实时检测虾血蓝蛋白

利用自行研制的便携式表面等离子体共振生物芯片检测系统,在生物芯片表面分别固定虾血蓝蛋白、虾血蓝蛋白的单克隆抗体、虾血蓝蛋白的单克隆抗体腹水作为生物探针,利用免疫反应的特异性,研究虾血蓝蛋白与其单克隆抗体的相互作用,分析动力学反应过程,建立标准曲线。用同一个生物芯片检测了8个抗体样品、7个未纯化的抗体腹水,为现场检测大量食品中过敏原、检测临床血清中过敏原特异性抗体进行基础研究。表面等离子体共振生物芯片检测过敏原,仪器便携、操作简便、无需标记、无污染、成本低,可进行现场大量样品的实时连续检测和快速筛选,适用于超市、集市、工厂等需要实时快速检测和质量监控的场所,也可以应用于临床上患者血清样品的过敏原抗体检测。     

抗河豚毒素单克隆抗体联酶前纯化条件优化的研究

目的 了解不同辛酸浓度下盐析法、不同离心力对抗河豚毒素(TTX)单克隆抗体的纯化效果以及纯化后酶标抗体性能的影响,优化出纯化抗TTX单克隆抗体的方法,为免疫学方法检测TTX提供依据.方法 在传统辛酸-硫酸铵蛋白纯化方法的基础上进行改进,考察不同的辛酸浓度、不同的离心力对抗TTX单克隆抗体纯化效果的影响,并将纯化后抗体与辣根过氧化物酶(HRP)连接,用间接竞争酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测酶标抗体的生物学活性及各项性能指标并比对.结果 不同方法纯化获得的抗体及其酶结合物的各项指标参数、活性不同,当腹水稀释液与辛酸体积比为1 000∶11、纯化过程中离心力10 000 r/min时纯化获得的抗体虽然产量有所下降但纯度较高,酶标抗体的生物活性、各项指标均最优.结论 经过对抗TTX单克隆抗体纯度、抗体中蛋白含量、酶标抗体各项性能指标的对比,优化出用于抗TTX抗体纯化用腹水稀释液与辛酸比值1 000∶11 (V/V)、离心力10 000 r/min的试验条件.     

PEGylated antibody in organic media

Antibodies were covalently conjugated with poly(ethylene glycol) (PEG) and the properties of the PEGylated antibodies in organic media were investigated. Two types of monoclonal antibody were used in this study. One was a monoclonal antibody (abzyme) that was prepared against a hapten mimicking a transition state of hydrolysis. Another was a monoclonal antibody against estrogen, which is not soluble in water. By electrophoresis and mass spectral analysis, the covalent conjugation with PEG chains was confirmed. The PEGylated antibodies bound to antigens and the PEGylated abzyme catalyzed a hydrolysis reaction in an aqueous solution. The PEGylated antibodies were soluble in dichloromethane and acetone and interacted with antigen either in dichloromethane or in acetone. In conclusion, PEGylated antibodies can be employed as analytical tools for water-insoluble analytes.     

兔单克隆抗体的发展及应用前景

单克隆抗体药在所有医药生物技术产品中很重要。目前单克隆抗体药物主要用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病,尤其在癌症治疗方面疗效突出。本文结合当前单克隆抗体技术的发展状况,重点论述了兔单克隆抗体技术的发展状况、技术优势及研究进展,并展望了兔单克隆抗体在临床诊断和治疗方面的应用前景。