干酪乳杆菌胞壁蛋白酶的分离及水解酪蛋白产物特性

通过DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100对干酪乳杆菌胞壁蛋白酶粗提物进行分离纯化,分离到酶比活力为12.50U/mg的CEP-1与16.67U/mg的CEP-2两种胞壁蛋白酶。CEP-1提纯倍数达到50,回收率为33.61%;CEP-2提纯倍数为66.68,回收率55.17%。对不同时间和底物浓度下CEP-1与CEP-2的α-酪蛋白和β-酪蛋白水解特性进行研究。结果显示,酪蛋白水解产物有显著的抗ACE与抗氧化活性,产生最高ACE抑制活性的水解条件为：CEP-2水解α-酪蛋白,时间6h,酶与底物质量比1:10,此时ACE抑制活性为84.66%;在酶与底物质量比1:40,水解时间4h条件下,CEP-2水解β-酪蛋白产生最佳的O2－ ·清除能力,其IC50为0.2138mg/mL。     

干酪乳杆菌蛋白酶的性质研究

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei,Lc)6033经增菌培养、超声波破碎、高速冷冻离心后获得粗酶液,并经70%～80%饱和度范围的硫酸铵分级沉淀初步提纯,酶活力回收率(OD275)为9.71%,酶液最适pH为6.5左右、最适温度为40℃,Co2 、Mn2 能显著增强酶液活力;Cu2 、Fe3 、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶液有较强的抑制作用;而Zn2 、碘乙酸和β-巯基乙醇的抑制作用较轻微。可见,酶液中可能含金属酶、丝氨酸酶及巯基酶等多种蛋白酶。     

干酪乳杆菌蛋白酶的性质研究

干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei,Lc）6033经增菌培养、超声波破碎、高速冷冻离心后获得粗酶液,并经70%～80%饱和度范围的硫酸铵分级沉淀初步提纯,酶活力回收率（OD275）为9.71%,酶液最适pH为6.5左右、最适温度为40℃,Co2+、Mn2+能显著增强酶液活力;Cu2+、Fe3+、乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）对酶液有较强的抑制作用;而Zn2+、碘乙酸和β-巯基乙醇的抑制作用较轻微。可见,酶液中可能含金属酶、丝氨酸酶及巯基酶等多种蛋白酶。      

干酪乳杆菌DI-1发酵产胞壁蛋白酶的培养基优化

采用Plackett-Burman和Box-Behnken方案,对影响干酪乳杆菌DI-1产胞壁蛋白酶(CEP)的MRS培养基成分进行筛选,结果表明,当在MRS培养基中添加磷酸氢二钾2.78g/L,柠檬酸二铵2.92g/L和乙酸钠4.36g/L时,CEP活性显著提高,此时酶活性为11.36U/mL,比基本MRS培养基提高了63.68%。在氨基酸和鸭肉水解肽添加试验中,当基础培养基中分别添加0.1g/L的精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺时,CEP的活性从6.94U/mL提高到11.11U/mL;当添加木瓜风味复合蛋白酶水解鸭肉蛋白多肽时,CEP活力提高到13.89U/mL。     

干酪乳杆菌6033蛋白酶降解肌肉蛋白质的作用研究

本试验将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，Lc)6033蛋白酶液按5％的比例分别加入肌浆蛋白和肌原纤维蛋白提取液，然后设定不同的pH值，于15℃培养7d，定时取样，测定反应后的pH值、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质的变化。结果发现：不同设定的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白试验组在反应初期pH值均稍稍降低，随着反应进程，各试验组的pH值呈现出逐步升高的趋势；其中，肌浆蛋白以pH5．0、4．5组的变化较为明显，肌原纤维蛋白则以pH6．0、5．0、4．5组的变化较为明显。经7d振荡培养后，电泳检测发现，各试验组肌浆蛋白均表现出分解现象，尤其以pH5．0组和pH4．5组更为明显；而肌原纤维蛋白也都表现出了明显的分解现象，尤以pH5．0组肌原纤维蛋白分解最明显。     

干酪乳杆菌KW3产胞外多糖的研究

从西藏农家开菲尔粒中筛选出1株高产胞外多糖(EPS)的乳酸菌KW3,生理生化试验和16S rDNA测序结果经鉴定其为干酪乳杆菌,在乳清培养基中的胞外多糖产量达到178mg/L。体外抗氧化试验表明:KW3胞外多糖总还原力达到(138.28±5.35)mgVC/g;当其质量浓度达到200μg/mL时,对DPPH自由基的清除率37.53%,FRAP值为(600.16±15.23)FeSO4.7H2Oμmol/L。体内抗氧化试验显示KW3胞外多糖可显著降低衰老小鼠血清、肝和脑组织中的MDA含量,提高其SOD活性和GSH-Px活性。     

副干酪乳杆菌及其胞外多糖的抗氧化性研究

以具有抗氧化性的嗜酸乳杆菌ATCC4356为对照,研究了1株副干酪乳杆菌H9的抗氧化性。分析了2株菌不同浓度下菌悬液和无细胞提取液的DPPH自由基清除能力、金属离子螯合能力和抑制脂质过氧化能力。并对H9菌株菌悬液煮沸灭活前后的抗氧化能力进行了比较。同时,对H9菌株自产的胞外多糖的抗氧化性进行了研究,测定了其在不同浓度下DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟自由基清除能力。结果表明:H9菌株的菌悬液和无细胞提取液抗氧化能力均随着浓度的升高呈上升趋势,浓度达到109cfu/mL时抗氧化能力最强,此时DPPH的清除能力分别达到(55.0±1.7)%和(47.5±1.8)%,螯合金属离子的能力分别为(15.2±1.2)%和(15.1±1.3)%,抑制脂质过氧化的能力分别为(76.2±1.1)%和(70.0±0.4)%。煮沸后菌悬液抗氧化能力趋势与未煮沸前一致,但同等浓度下煮沸处理会降低其抗氧化能力。H9菌株自产胞外多糖也具有较强的抗氧化能力,并随着多糖浓度的升高抗氧化能力增强。结果表明H9菌株的抗氧化性可能与活细胞和菌体代谢产物密切相关。     

干酪乳杆菌蛋白酶的分离与性质鉴定

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,Lc)6033经增菌培养、超声波破碎、高速冷冻离心后获得粗酶液,并经70%～80%饱和度范围的硫酸铵分级沉淀初步提纯,酶活力回收率(OD275%)为9.71%;酶液最适pH值为6.5左右、最适温度为40℃,Co2+、Mn2+能显著增强酶液活力,Cu2+、Fe3+、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶液有较强的抑制作用,而Zn2+、碘乙酸和β-巯基乙醇的抑制作用较轻微,可见酶液中可能含金属酶、丝氨酸酶及巯基酶等多种蛋白酶.     

具ACE抑制活性干酪乳杆菌LC-15发酵乳制备条件的研究

干酪乳杆菌LC-15发酵酸乳具有良好的血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE）抑制效果，在“三高”现象越来越严重的今天，这种具有抗高血压活性的酸乳必将具有广阔的商业前景。以具有较高ACE抑制活性的干酪乳杆菌LC-15发酵制备酸乳，以发酵时间、发酵温度、接种量和稳定剂组合为考察因素，结合SAS响应面分析手段，通过感官评分，确定了干酪乳杆菌LC-15发酵酸乳的最佳发酵条件为接种量4％，发酵温度37℃，发酵时间14h，最适稳定剂组合为：果胶0．1％，明胶0．15％，变性淀粉0．15％。     

干酪乳杆菌胞外多糖LCP1的流变性研究

通过对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖LCP1溶液流变性质研究发现,高浓度LCP1溶液呈剪切变稀,低浓度时,剪切速率对黏度没有影响,溶液黏度随温度升高下降明显,pH对LCP1溶液黏度影响很小,盐可以降低LCP1溶液黏度,但黏度降低与盐浓度有关,通过黏弹性研究发现LCP1水溶液不能形成胶体,乌氏黏度计测得LCP1水溶液固有黏度[η]为1.930 dL/g。     

嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取优化

为了获得较高酶活力的嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶(CEP),对嗜酸乳杆菌CEP的提取方法进行优化。经过比较超声波破碎法、Ca2+-free法、溶菌酶裂解3种方法,确认溶菌酶裂解法结合使用非离子清洁剂破壁是提取嗜酸乳杆菌CEP的最佳方法。在单因素试验的基础上,采用正交试验对嗜酸乳杆菌CEP的提取工艺进行优化,得出嗜酸乳杆菌CEP的最佳提取方法：用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、TritonX-100添加量1%、1.5mg/mL溶菌酶,pH 7.8)悬浮菌体(20mL/g),37℃保温3h,4℃、4500r/min离心20min,取上清液。溶菌酶裂解法提取CEP过程中各因素对CEP提取效果的影响依次为：溶菌酶质量浓度＞裂解pH值＞TirtonX-100添加量＞保温时间。     

嗜酸乳杆菌JQ-1胞壁蛋白酶的提取及分离纯化

对嗜酸乳杆菌JQ-1胞壁蛋白酶（CEP）的提取条件进行了研究,确定了胞壁蛋白酶的最佳提取条件,并对粗酶进行了分离纯化。采用溶菌酶结合非离子表面活性剂法对胞壁蛋白酶进行提取,得出其最佳提取条件为:菌粉与裂解液比例为1∶5（g/mL）,33℃下保温4.0h,离心取得的上清液即为粗酶液。通过聚乙二醇-20000浓缩,DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100两步层析对粗酶液进行分离纯化,蛋白酶提纯倍数达到50.951倍,最后回收率为12.569%。且SDS-PAGE电泳检测蛋白酶为单体结构,分子量约为45ku。用纯化后的CEP水解β-酪蛋白,水解液的ACE抑制率为48%。      

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取

确定提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的最佳方法和最佳提取条件。在单因素试验的基础上,采用多指标正交试验设计和综合平衡分析法研究溶菌酶结合非离子表面活性剂法提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的裂解液成分和提取条件。结果表明：裂解液的成分为50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、体积分数3% 吐温-20、2mg/mL 溶菌酶、pH8.9;提取条件为裂解液与菌体的比例10:1(V/m)、保温时间5h、保温温度37℃时酶比活力达38.957U/mg,此时可最大效率的获得发酵乳杆菌的细胞壁蛋白酶。     

瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶提取研究

瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个非常重要的蛋白酶。本实验采用螯合Ca2+的方法对瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取进行了研究,并确定了细胞壁蛋白酶提取的最佳实验条件。菌体用含有30mmol/LCaCl2的50mmol/LTris-HCl(pH7.10)缓冲液洗涤三次,然后用含有45mmol/LEDTA-Na2的50mmol/LTris-HCl(pH6.50)缓冲液悬浮,43℃保温,蛋白酶就会释放出来,90min后取出离心(4500r/min,20min,4℃),上清液即为粗酶液。粗酶液再经DEAE Sepharose CL-6B纯化,比酶活力提高了1.8倍。     

固定化瑞士乳杆菌蛋白酶酶解乳清蛋白生产ACE抑制肽的条件优化

以乳清浓缩蛋白WPC-80为原料,研究固定化瑞士乳杆菌蛋白酶酶解WPC-80生产血管紧张素转化酶（angiotensinⅠ-converting enzyme,ACE）抑制肽的工艺条件。通过单因素试验和响应面方法研究了酶解温度、酶解pH值、底物与酶质量比（[S]/[E]）、酶解时间对固定化瑞士乳杆菌蛋白酶制备ACE抑制肽的影响,确定了酶解乳清蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为：温度37 ℃、pH 7.5、[S]/[E]＝15%、酶解时间8 h。在此条件下,酶解产物的水解度为（6.05±0.36）%,ACE抑制率为（59.54±0.61）%。     

壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶的条件研究

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,采用交联-吸附法对瑞士乳杆菌蛋白酶的固定化条件进行研究。在单因素试验基础上,以固定化酶活力为主要指标,研究凝结液、壳聚糖质量浓度、酶用量、交联时间、戊二醛质量浓度对瑞士乳杆菌蛋白酶固定化的影响。运用响应面对固定化条件进行优化,确定瑞士乳杆菌蛋白酶的最优固定条件：凝结液为4g/100mL NaOH-甲醇(体积比3:1)、壳聚糖质量浓度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交联时间1h、戊二醛质量浓度0.40g/100mL,此时固定化酶活力为28.67U。     

嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质的研究

为优化CEP的分离纯化方法,采用聚乙二醇(PEG)-20000浓缩粗酶液,用超滤离心管过滤酶液,40%~60%硫酸铵盐析分级沉淀,Sephacryl-S-300HR纯化,并通过Native-PAGE切胶回收得到纯酶。所得CEP的分子质量为28.3ku,比酶活力62.066U/mg,最适温度32℃,最适pH6.5,耐热性比较强,耐酸性明显好于耐碱性。Co2+、Mg2+、Ca2+对CEP有激活作用;Ba2+、Mn2+、K+、Na+对CEP的活力影响不大;Zn2+、Ni2+则表现出较强的抑制CEP活性作用;EDTA对CEP活性有抑制作用,表明CEP是一种金属离子激活酶;PMSF对CEP有显著抑制作用,表明CEP是一种丝氨酸蛋白酶。用嗜酸乳杆菌CEP水解乳清蛋白,其酶解液对ACE的抑制率为56.31%,表明CEP水解乳清蛋白可以产生ACE抑制肽。     

超声波破碎法提取瑞士乳杆菌氨肽酶条件的优化

目的：确定超声波破碎细胞提取瑞士乳杆菌氨肽酶的最佳条件。方法：采用单因素试验和响应面法对菌体浓度、超声波破碎功率、破碎时间进行研究。结果：菌体浓度、超声波破碎功率、破碎时间对超声波破碎程度都存在一定的影响,其中破碎时间影响最为显著。超声波破碎提取氨肽酶的最适条件为菌体浓度0．0238g／ml,破碎功率300W,破碎总时间26min（超声3s,间隔5s）。破碎后得到粗酶液总酶活力为72．99U。结论：采用超声波破碎方法可以较好地提取氨肽酶,运用响应面分析法优化超声波破碎条件是可行的。     

分步酶解酪蛋白制备小分子ACE抑制肽

通过模拟胃肠道消化,采用单酶和复合酶分步水解酪蛋白获得小分子的血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制肽。首先通过胃蛋白酶水解条件的优化获得具有高ACE抑制活性肽。然后以此为底物通过胰蛋白酶和胰凝乳蛋白复合酶水解条件优化获得具有高ACE抑制活性的小分子肽。结果表明：第一步的胃蛋白酶水解最优条件为：[E]/[S]=6%、[S]=0.015g/mL、pH=1.8、t=37℃、t=2h,水解产物稀释10倍后ACE抑制率为84.5%,分子质量集中在2000D以下;第二步的复合酶水解最优条件为：m胰蛋白酶(6%):m胰凝乳蛋白酶(3%)=2:1、pH=7.8、t=48℃、t=5h,水解产物稀释10倍后ACE抑制率为85.9%,分子质量集中在500D以下。研究表明,通过分步酶解选择合适的酶解条件可以获具有较高ACE抑制活性的小分子肽。