化学发光免疫法检测食品中恩诺沙星残留的研究

建立了基于多克隆抗体的化学发光免疫检测技术,用于测定动物源性食品中恩诺沙星残留含量。反应条件优化结果为:抗体包被最佳稀释倍数为64000倍,最佳酶标抗原稀释倍数为256000倍。结果显示:该方法的回归曲线方程为y=-13.898x+110.38(R2=0.9893),检测线性范围为3~810pg/mL,IC50为69.63pg/mL,IC10为1.41pg/mL;鸡肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜、牛奶空白组织样品中恩诺沙星的最低检测限分别为3.76、4.59、2.85、2.65、4.20pg/mL,最低定量限分别为6.13、7.35、3.57、3.73和6.48pg/mL,回收率在88.28%~102.6%,板内和板间的平均变异系数分别为2.61%和4.71%。表明本研究建立的化学发光免疫检测方法满足动物源性食品恩诺沙星残留的检测要求。     

恩诺沙星可视化凝胶柱快速免疫检测方法研究

建立一种动物源性食品中兽药恩诺沙星可视化凝胶柱快速免疫检测新方法。采用活化酯法制备恩诺沙星与辣根过氧化氢酶(HRP)的偶联物作为酶标抗原。整个检测在一个标准的1 m L SPE固相萃取柱中进行,柱中包含两层:一个结合了恩诺沙星特异性抗体的凝胶检测层和一个结合了HRP抗体的凝胶质控层。将样品提取液与酶标抗原预混合后加入到检测柱中,基于抗原抗体的竞争结合反应和辣根过氧化物酶的酶促反应,根据检测柱的检测层颜色的深浅和有无来定性半定量检测恩诺沙星的含量。该凝胶检测柱的检测限为5μg/L,整个检测过程可以在10 min内完成,猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、虾肉和牛奶等动物源性食品中恩诺沙星检测限为100μg/kg。该方法具有准确、灵敏、特异性好、操作简便快速、成本低等优势,适合动物源性食品中恩诺沙星残留的快速筛查。     

量子点标记免疫亲和凝胶柱快速检测动物组织中恩诺沙星

目的:建立一种检测动物组织中残留的兽药恩诺沙星(ENR)的量子点标记免疫亲和凝胶柱快速检测新方法。方法:将恩诺沙星特异性抗体偶联到溴化氢活化的琼脂糖凝胶上,制备抗体胶,将抗体胶装入标准的1mL SPE固相萃取柱制成恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱。采用混合酸酐法制备恩诺沙星包被抗原(ENR-OVA),采用活化酯法将ENR-OVA偶联到水溶性量子点(QDs)上制备荧光信号探针QDs-OVA-ENR。将待测样品和荧光信号探针QDs-OVA-ENR分别加入检测柱中,基于抗原抗体的竞争结合反应,样品中的恩诺沙星和荧光信号探针QDs-OVA-ENR竞争结合检测柱中抗体。通过目测检测柱体的荧光强弱,定性半定量检测恩诺沙星的含量。结果:该量子点标记恩诺沙星免疫亲和凝胶检测柱的检测限(LOD)为2μg/L,对食源性动物组织样品的检测限为20μg/kg。检测过程不超过5 min。结论:该方法操作简便,灵敏度高,检测时间短,结果易于判断,可满足食源性动物组织中恩诺沙星残留的现场快速检测要求。     

荧光免疫层析法快速测定牛奶中头孢氨苄残留量

采用荧光免疫层析法结合现场检测仪建立牛奶中头孢氨苄残留的快速定量检测方法。方法 利用反向微乳技术合成稀土铕荧光纳米颗粒,与头孢氨苄单克隆抗体结合制备荧光检测探针,以头孢氨苄卵清蛋白全抗原和羊抗小鼠抗体分别作为检测线和质控线制备免疫层析试纸条,结合现场检测仪建立牛奶中头孢氨苄残留的快速定量检测方法。结果 试验结果表明,该方法对头孢氨苄的检测限为0.16 ng/ml,半数抑制浓度(IC₅₀)为0.6 ng/ml,线性范围为0.16～5 ng/ml,标准添加回收率为100%～115%之间,与头孢菌素类及青霉素等其他12种抗生素的交叉反应率均＜0.01%,与ELISA方法比较,测定结果相关性良好。结论 本试验所建立的荧光免疫层析法快速检测牛奶中头孢氨苄残留,具有简便、快速、灵敏、直观的优点,可用于抗生素残留的筛查,极具推广和应用价值。     

胶体金免疫层析法快速检测牛奶中环丙沙星残留

针对牛奶中恩诺沙星的代谢物环丙沙星残留的问题,该研究开发一种胶体金试纸条快速检测牛奶中的环丙沙星残留。研究制备环丙沙星包被抗原,对环丙沙星抗体进行表征,优化胶体金标记条件,选用最佳标记pH和最佳蛋白添加量,以硝酸纤维素膜为固相载体,环丙沙星包被抗原为检测带(T带),羊抗兔二抗为质控带(T带)。依据免疫竞争法原理,建立胶体金免疫层析试纸条快速检测牛奶中环丙沙星的方法,方法检出限为6.25 ng/mL,对牛奶样品的检出限为12.50 ng/mL。样品前处理方法简单,在10 min内即可目测判断结果。     

牛乳酪蛋白及其水解物的纳米金荧光增强检测方法

基于抗原抗体特异性反应和纳米金荧光增强效应构建了牛乳酪蛋白及其水解物的新型检测方法。实验以纳米金为载体,首先将抗体以非共价键结合于纳米金表面,根据抗原抗体特异性反应与异硫氰酸荧光素(FITC)标记蛋白结合,基于纳米金荧光增强效应使标记体系荧光达到最大,待测蛋白和FITC标记蛋白竞争性与金标抗体结合,通过检测荧光强度,从而间接测定蛋白质含量。通过一系列优化实验建立检测体系,结果为:酪蛋白荧光标记率为1.35,为充分标记;检测体系中抗原的最适加入量为30μg/mL。方法检测线性范围为0.2～1μg/mL,最低检测限为0.2μg/mL,可重复试验变异系数均小于6%。研究结果表明所建立的纳米金荧光增强检测方法具有简单快速、操作简单、重复性好,可用于牛乳酪蛋白及其水解物的定量检测。     

ELISA法检测牛奶中链霉素残留量

从抗原的制备、抗体的获得、酶结合物的合成等基础入手,建立了牛奶中链霉素残留量快速筛选检测方法,检测历时60min,方法的临界值为110μg/L。经试验证明该方法检测限可达20μg/L或以下,奶样用水稀释后可直接测定,批内变异系数小于20%,板间变异系数小于30%,200μg/L质量浓度处空白奶样添加回收率在60%-110%,符合快速筛选方法的要求。     

恩诺沙星时间分辨荧光免疫分析方法的建立

目的：采用时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术建立高灵敏的恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)快速检测方法。方法：以包被抗原(ENR-OVA)包被微孔板,与游离的恩诺沙星共同竞争抗恩诺沙星抗体,以铕(Eu3+)标记的羊抗兔抗体进行示踪。结果：方法的批内变异系数小于10%、批间变异系数小于15%,平均回收率为91.62%,灵敏度为5ng/L,可测范围为0.01～100μg/L,ED20、ED50和ED80分别为0.088、3.40μg/L和32.81μg/L。结论：ENR-TRFIA方法稳定性好、可测范围宽,具有很好的应用前景。     

基于吖啶酯-磁微球的自动化学发光免疫法检测赭曲霉毒素A

该研究建立了一种基于吖啶酯-磁微球的自动化学发光免疫法（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA）检测牛奶中的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）。采用磁微球偶联二抗,吖啶酯标记OTA-BSA偶联物,优化了磁微球浓度、OTA抗体浓度、吖啶酯标记物浓度、抗体和标记物稀释液、反应时间、样品预处理条件等各种CLIA方法的试验条件。结果表明,CLIA方法对OTA的检出限为6.38 ng/kg,半抑制浓度（IC50）为31.40 ng/kg,线性范围为11.23~99.20 ng/kg,批内和批间的变异系数<8%;测定牛奶样品中的OTA时,检出限为25.52 ng/kg,IC50为125.60 ng/kg,线性范围为44.92~396.80 ng/kg,添加回收率为95.08%~105.83%;对赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C的交叉反应率为6.52%和24.57%,对其他真菌毒素均无明显的交叉反应;对牛奶样品的检测结果与高效液相色谱-串联质谱法一致;且CLIA方法的试剂能在2~8 ℃稳定保存9个月以上。该研究建立的CLIA方法,具有灵敏、准确、快速和操作便捷等特点,检测时长仅30 min,尤其适用于大规模牛奶样品中OTA残留的快速筛查。     

Elispot assay检测牛奶中庆大霉素

为了建立快速检测牛奶中庆大霉素的Elispot assay,采用制备GM免疫抗原获得抗GM多克隆抗体。将检测抗原点阵在PVDF膜上,通过检测抗原和样品中GM竞争结合抗GM多克隆抗体,酶标结合物催化底物显色,根据颜色的有无及深浅判读结果,从而建立了检测牛奶中GM的Elispot assay。该方法的检测阈值为10 ng/mL,检测时间为40 min,可对样品实现半定量检测。该方法制备的试纸条于4℃密封保存90 d仍可用于检测;与多种结构类似物未见交叉反应;其结果与酶联免疫方法一致。     

恩诺沙星化学发光免疫分析试剂盒的研制

主要研制一种基于鲁米诺-辣根过氧化物酶体系的化学发光免疫分析试剂盒,用于检测食品中的痕量恩诺沙星残留。反应条件优化结果为:最佳包被抗原浓度为0.5ng/mL,最佳抗体稀释倍数为1:2000,药物稀释液为0.01mol/L的PBST溶液,一抗反应时间为30min。研究结果显示:本文研制的试剂盒的回归曲线方程是y=-22842x+172936,检测线性范围是0.024～2.76ng/mL,IC50为0.106ng/mL,对蜂蜜、牛奶、鱼肉和虾肉样本的添加回收率在96%～116%、90%～97%、92%～112%、86%～112%之间,批内和批间变异系数均小于15%,试剂盒在4℃下有效期为180d。     

恩诺沙星抗体免疫检测及其分子识别机制研究

兽药恩诺沙星对人体具有较强的毒副作用,检测恩诺沙星残留对保障食品安全具有重要的作用。本研究将恩诺沙星与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物注射免疫BALB/c小鼠制备恩诺沙星单克隆抗体,并建立基于单克隆抗体的酶联免疫法检测样品羊奶中恩诺沙星的方法。将筛选出的杂交瘤细胞注射小鼠提取腹水,并以此单克隆抗体建立直接竞争ELISA方法。其半数抑制率(IC50)为0.71±0.05 ng/m L,最低检测限(IC15)为0.04±0.02 ng/m L。检测羊奶样品含恩诺沙星在10~200 ng/m L时回收率为96.56~105.10%,且与HPLC法检测呈良好线性关系(R2=0.9998)。最后利用计算机生物信息学构建恩诺沙星抗体的可变区三维结构并与抗原进行分子对接。结果显示Arg98、Asp99、Gly101、Thr50、Ser51、Ala82、Tyr85等氨基酸残基在抗体抗原识别过程中起关键作用。这些信息对今后抗体结构修饰具有理论指导意义。     

基于金纳米颗粒信号放大ELISA检测食品中恩诺沙星

以金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）为信号放大载体,利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的二抗为信号探针,建立一种基于AuNPs的信号放大酶联免疫检测方法（AuNPs signal amplification enzyme-linked immunosorbent assay,AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA）,检测食品中恩诺沙星（enrofloxacin,ENR）。该方法对ENR的检测限（IC15）为5×10－4?ng/mL,半数抑制浓度（IC50）为0.24?ng/mL,检测范围为0.16～500?ng/mL,与建立的传统ELISA方法（IC50=8.76?ng/mL）相比,显著提高了检测灵敏度,并且该方法与环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星交叉反应率均小于0.1%,具有良好的特异性。该AuNPs-HRP-IgG?ic-ELISA方法的实用性得到了样品添加回收实验和商业化ELISA检测试剂盒的验证,其在牛奶样品中的加标回收率可达80.52%～102.66%,适用于实际牛奶样本中ENR的快速灵敏检测,也为建立其他食品危害物质的精准检测技术开发提供参考。     

酶联免疫吸附法检测动物源性食品中恩诺沙星残留量

为检测动物源性食品中恩诺沙星残留量,评估基于卵黄抗体的间接竞争酶联免疫吸附法检测恩诺沙星的可行性,用活性脂法将恩诺沙星同卵清蛋白偶联制备免疫原和包被抗原并用紫外光谱进行验证。用聚乙二醇-6000提取卵黄抗体。五免之后效价达到峰值1∶32 000。用间接竞争酶联免疫吸附法确定包被原质量浓度、卵黄抗体的稀释倍数和IC_(50)分别为38 ng/m L、1∶64 000和18.207 ng/m L,回归曲线方程为y=0.891 1-0.016 5x(R~2=0.990)。结果表明,制备的抗恩诺沙星卵黄抗体为进一步建立检测动物源性食品中恩诺沙星的残留的免疫方法提供参考依据。     

一种新型玉米赤霉烯酮的定量检测方法

采用间接竞争法原理和液相芯片技术平台,选用玉米赤霉烯酮单克隆抗体(Monoclonal Anti-ZEN)对玉米赤霉烯酮(ZEN)定量检测方法进行探索。将ZEN-BSA与36﹟微球偶联,同时加入待检的游离的ZEN小分子和其标记有生物素的ZEN单克隆抗体,偶联抗原和目标抗原竞争结合生物素标记抗体,通过报告分子SA-PE在532 nm波长的激光下,即可检测出报告分子发出的荧光强度,荧光强度与待检ZEN的量成反比。该研究优化了液相反应体系中ZEN单克隆抗浓度、确定了ZEN单抗临界饱和浓度以及抗原抗体最佳孵育时间,其中ZEN单抗临界饱和浓度为2.0μg/mL,偶联抗原和抗体最佳孵育时间为3h。研究所建立的ZEN液相芯片定量检测方法,以国际通用的IC50作为衡量标准,其检测灵敏度为0.005 4μg/mL,线性范围为0.000 8～0.04μg/mL。应用该方法对脱脂牛奶和全脂牛奶进行加标回收检测,平均回收率均大于75%。该方法简化了样品的纯化和分离步骤,经过实际样品的检测,证明方法灵敏、稳定、快速、简便,适用于大量样本的检测。     

A multiple lateral flow immunoassay based on AuNP for the detection of 5 chemical contaminants in milk

Melamine (MEL), enrofloxacin (ENR), sulfamethazine (SMZ), tetracycline (TC), and aflatoxin M₁ (AFM₁) are the main chemical contaminants in milk. It is necessary to detect these miscellaneous chemical contaminants in milk synchronously to ensure the safety of the milk. In this study, a multiple lateral flow immunoassay (LFIA) was developed for the detection of MEL, ENR, SMZ, TC, and AFM₁ in milk. Under optimal experimental conditions, the cutoff values were 25 ng/mL for MEL, 1 ng/mL for ENR, 2.5 ng/mL for SMZ, 2.5 ng/mL for TC, and 0.25 ng/mL for AFM₁ in milk samples. The limits of detection of LFIA were 0.173 ng/mL for MEL, 0.078 ng/mL for ENR, 0.059 ng/mL for SMZ, 0.082 ng/mL for TC, and 0.0064 ng/mL for AFM₁. The recovery rates of LFIA in milk were 83.2–104.4% for MEL, 76.5–127.3% for ENR, 96.8–113.5% for SMZ, 107.1–166.6% for TC, and 93.5–130.3% for AFM₁. The coefficients of variation were all less than 15%. As a whole, the developed multiple lateral flow immunoassay showed potential as a highly reliable and excellent tool for the rapid and sensitive screening of MEL, ENR, SMZ, TC, and AFM₁ in milk.     

酶标抗原直接竞争ELISA检测食品中氟喹诺酮类药物多残留

固相包被恩诺沙星抗体,辣根过氧化物酶标记的抗原与标准品（或样品）中氟喹诺酮药物竞争结合抗体,建立了高效、高灵敏的氟喹诺酮药物直接竞争酶联免疫吸附分析检测方法。优化反应条件后,得到方法的IC50为2.04 μg/L,灵敏度为0.15 μg/L,线性范围0.3～15 μg/L;方法可以检测12 种氟喹诺酮药物,在生乳、鸡肉、鱼肉和虾肉4 种样品中12 种药物的回收率为70%～121.5%。     

胶体金标免疫固相膜检测动物性食品中氟甲喹

氟甲喹(flumequine,FLU)是动物专用的抗生素,滥用或超标使用会造成动物性食品中的残留问题,对人类健康造成危害。以活泼酯法制备氟甲喹完全抗原,免疫新西兰大耳白兔获得抗血清,通过间接竞争酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定抗血清的效价和亲和性,效价为1∶12 800,纯化后抗体的IC50达到0.055 ng/mL。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,并用于标记FLU多克隆抗体制备免疫金。以硝酸纤维素膜为固相载体,包被上包被原和酶标二抗作为检测线和控制线,优化检测条件:封闭液为5%脱脂乳、酶标二抗稀释40倍、包被量1.0μg、免疫金稀释度1∶5(体积比)、金标抗体与待测溶液混合比例1∶5(体积比)。在最优条件下,制成FLU胶体金标记免疫固相膜,最低检出限达40μg/L。建立的胶体金标记固相膜免疫检测方法适于大量样品的快速定性筛查。