55株芽孢杆菌16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析

采用16S rRNA基因序列分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CCIC)保藏的55株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行复核鉴定。菌株经纯化培养,以改良CTAB法提取总DNA,采用细菌16S rRNA通用引物、TD-PCR方法(touchdown-PCR)进行16S rRNA基因序列扩增,PCR产物纯化后直接进行序列测定,序列经人工校对后用Clustal X进行比对分析,最后用MEGA3.1软件构建系统发育树。系统发育分析结果表明:55株枯草芽孢杆菌中有52株菌种与原鉴定结果一致,有3株菌种与原鉴定结果存在差异,其中2株鉴定结果为巨大芽孢杆菌(B.megaterium),另1株鉴定结果为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。     

16S rRNA二级结构分析在微生物分类鉴定中的应用

综述了16S rRNA二级结构图形分析在微生物分类鉴定中的应用,并采用该方法比较了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)模式株16S rRNA可变区二级结构的差异,结果表明,该方法可以应用于细菌相近种间的区分。     

兼香型白酒不同轮次及操作的酒醅细菌种类与数量分析

采用稀释平板分离法和细菌16S r DNA序列同源比对方法,对白云边机械化班组和传统班组第1轮至第7轮入池前堆积料及第3轮至第7轮出池酒醅中细菌的数量和种类进行了分析比较。结果表明,机械化班组和传统班组的前5轮入池堆积料中细菌活菌数均随着发酵轮次的增加而不断减少。从机械化和传统工艺组的酒醅中共分离获得36株细菌,将这些细菌鉴定为1个属4个种,分别为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。不同轮次的白云边机械化班组和传统班组酒醅中的主要细菌均为B.amyloliquefaciens和B.licheniformis,表明这2种芽孢杆菌是白云边酒醅中的优势细菌。从2种操作工艺的酒醅中分离的细菌群落结构无明显差异。     

醋醅中分离菌株W321种属鉴定的研究

试验以从醋醅中分离纯化到的菌株W321为研究对象,为进一步开发利用这一菌株,根据菌株W321的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列,对其进行种属鉴定的研究.经形态与生理生化鉴定菌株W321属于芽孢杆菌属,16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性达到了99％,表明与枯草芽孢杆菌极为相似,因而将菌株W.鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).     

产聚γ-谷氨酸菌株的筛选及鉴定

从高温处理过的豆瓣酱等样品中分离获得1株细菌菌株L536,其产物经纸层析分析及氨基酸组成分析鉴定,确定是聚谷氨酸。菌株L536通过形态特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolique faciens)。该菌株在37℃,180 r/min振荡培养48h,产γ-PGA可达15 g/L。     

四川晒醋醋醅中一株产纤维素酶的芽孢杆菌分离筛选

以四川晒醋醋醅为研究对象,从醋醅中筛选出1株产纤维素酶活较高的芽孢杆菌,并对其生理生化特性进行研究。通过平板划线和平皿生化反应对目的菌株进行分离纯化,通过形态特征以及16S rDNA同源序列分析对分离菌株进行鉴定。结果表明,筛选出的产纤维素酶活较高的菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),产纤维素酶活为161.33 u/g。     

柠檬苦素降解菌的分离筛选与分类鉴定

以新鲜醋醅为分离源,分离得到5株具有柠檬苦素降解活性的菌种,对柠檬苦素的最大降解率可达(58.86±2.81)%,发酵液的酶活力为(120.09±1.32)U/mL。基于形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果,所得5 株菌均属芽孢杆菌属(Bacillus),其中2株为Bacillus siamensis,1株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),1株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),降解能力最强的1株为芽孢杆菌种Bacillus tequilensis。     

贵州浓香型白酒窖池可培养细菌系统发育分析

从贵州某名酒厂浓香型白酒窖泥和酒醅中分离到477 株细菌,通过形态特征和生理特性检测等传统方法鉴定,发现绝大多数为芽孢杆菌(446 株),占总细菌株数的93.50 %,将形态和生理生化特征一致的芽孢杆菌归类为XJ-1～XJ-20二十大类群.并采用16S rDNA序列分析和测序,构建系统发育树.结果表明,芽孢杆菌属菌株中,以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为主,占总芽孢杆菌数的32.96 %;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 和栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)也占有相当的比例,还有一定数量的Bacillus niabensis和巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)以及少量的球状芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)和不确定种芽孢杆菌(Bacillus sp.).除芽孢杆菌属菌株之外,还分离出极少量的短短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的不确定种菌株,占已分离总芽孢杆菌数的1.57 %.表明贵州地区浓香型白酒窖池中微生物具有明显的多样性,且地衣芽孢杆菌为其明显的优势种群,这和四川境内酒厂中的微生物类群相似,但也有区别.     

酱油中微生物及防腐体系的效能研究

从微生物的分离鉴定、挑战实验和抗二次污染方面对广东省某调味品厂生产的酱油防腐体系的效能进行了研究.采用平板培养法进行微生物分离和计数,未分离出真菌,分离的细菌数达到49 cfu/mL.对其中的4株细菌进行了生理生化特性研究和16S rRNA基因序列分析,其中1株细菌鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),1株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),另2株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium).在对酱油防腐体系进行的挑战试验和抗二次污染试验中,发现酱油中的微生物数量逐渐减少.综合结果分析表明,添加了防腐剂的酱油具有较强的抑菌效果,其防腐体系能够满足食品卫生要求.     

甘蔗糖厂成糖工序生产线样品中部分细菌菌株的鉴定

通过16S rRNA序列分析,结合微生物的形态学观察、生理生化试验对甘蔗糖厂成糖工序生产线检出的部分细菌进行了分离鉴定。结果显示,从甘蔗糖生产线样品中获得常见的4株菌,菌株S-1鉴定为克氏库克菌(Kocuria kristinae)、菌株S-2为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、菌株S-3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、菌株S-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。因此,糖厂应该加强微生物污染源和污染途径的监控,以此保证甘蔗糖品质。     

Composition of the bacterial population of refrigerated beef, identified with direct 16S rRNA gene analysis and pure culture technique

The composition of the dominating population of freshly cut beef, and beef stored at 4 degrees C for 8 d, was studied by direct analysis of the 16S rRNA gene (PCR amplification, cloning and sequencing) and compared with pure culture technique where the isolates picked from the viable plate count were identified by sequencing of the 16S rRNA gene. The composition of the bacterial population was recorded at two different time points, at the start when the viable plate count of the meat was 4 x 10(2) colony forming unit (cfu) per cm(2) and when it was 5 x 10(7) cfu per cm(2). Direct gene analysis by PCR amplification generated 30 clones, and 79 isolates were picked from the plate count, and identified by 16S rRNA gene sequencing. At the low initial bacterial load of the beef, the two sampling strategies showed variations in the composition of species. Direct 16S rRNA gene analysis revealed a domination of Bacillus-like sequences while no such sequences were found in isolates from the viable plate count. Instead the population of the plate count was dominated by Chryseobacterium spp. In contrast, the two sampling strategies matched on the multiplying beef population, where both methods indicated Pseudomonas spp. as the dominating group (99% of the population-sequences), irrespectively of sampling strategy. Pseudomonas panacis/Pseudomons brennerii was the dominating taxon (99% similarity to type strain), but sequences with highest similarity to Pseudomonas lundensis (99%), Pseudomonas beteli (99%) and Pseudomonas koreensis (100%) were also found.     

宜宾浓香型白酒窖泥中细菌的系统发育多样性

采用纯培养和免培养(culture-independent)分析方法,对宜宾多家规模以上白酒企业成熟窖泥细菌多样性进行了研究。采用改良牛肉膏蛋白胨培养基(NA)和高氏I号分离培养基分离细菌(包括放线菌),并评价菌株的乙醇耐受能力和低pH耐受能力。构建了窖泥样品总DNA的16S rRNA基因克隆文库。分别挑选不同培养特征的89株细菌纯培养物和427个基因克隆的16S rRNA基因序列,进行系统发育分析。89株纯培养物分属于13个属,以Streptomyces(39株)和Bacillus(27株)为优势属。纯培养菌株中,具备7%浓度乙醇耐受能力和低pH(4.5)耐受能力的分别有16株和10株。挑取的克隆子经测序、去除嵌合体后,得到了406个有效序列,并在97%的序列相似性水平上可将其分为75个OTU(Operational Taxonomic Unit),分属于Clostridia、Bacilli、Acti-nobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8个纲。其中Clostridia为绝对优势菌群,包含50个OTU、227个克隆子;Bacilli包含11个OTU、128个克隆子,为次优势菌群。证明宜宾浓香型白酒窖泥中细菌群落存在丰富的系统发育多样性。     

永春老醋不同生产阶段细菌和真菌多样性动态变化特征分析

以16S rRNA和18S rRNA基因为分子标记,应用高通量测序技术分析了福建永春老醋发酵中(Y1)、1个月成品(Y2)、1年陈酿(Y3)和10年陈酿(Y4)共4个不同生产阶段中的细菌与真菌群落多样性.结果表明,对于细菌组成,Y1、Y2和Y3三个阶段优势菌纲皆为 α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)...     

中高温大曲和曲房细菌群落的相关性

为了解多粮浓香型白酒厂中高温大曲和曲房细菌群落的相关性,采用改良NA培养基和高氏I号培养基对细菌进行分离。经过表观去除冗余后,从多家规模多粮浓香型白酒厂的中高温大曲生产环境(曲房)和大曲分离得到217株细菌。对这217株菌进行16S rRNA基因的系统发育分析及纤维素维素分解能力、淀粉水解能力、7%乙醇耐受能力和pH 4.5耐受能力进行了检测。发现中高温大曲和曲房细菌群落均呈现出一定的多样性,二者的优势菌均为Bacillus,且分别以Staphylococcus和Streptomyces为次优势属;中高温大曲和曲房环境中均存在一定数量具有应用前景的微生物资源;2个细菌群落组成及具有纤维素分解能力、淀粉水解能力和7%乙醇耐受能力的菌株分布均存在高度的一致性,环境对中高温大曲细菌群落影响巨大。     

传统发酵成熟期豆瓣酱醅中的微生物群落分析

为了探明传统发酵成熟期豆瓣酱醅中的功能微生物种类,采用免培养法(基因克隆文库的构建技术)对发酵成熟酱醅中的细菌16SrRNA和真菌18SrRNA进行了分析。结果表明,成熟酱醅中存在的细菌分别为Staphylococcus属、Lactobacillus属和Tetragenococcus属,其与具有最高同源性的菌株的相似性分别为99%、98%、99%。成熟酱醅中发现的真菌共5个属,分别为Zygosac charomyces属、Rhizochaete属、Aspergillus属、Rhodotorula属和Phaseoleae environmental sample,与具有最高同源性的菌株的相似性均为99%。      

植物乳杆菌及其近缘种部分看家基因的系统发育分析

本文研究了16S rRNA基因、pheS和pyr G部分基因序列对Lactobacillus plantarum(L.plantarum)及其近缘种的区分能力,采用分离自酸面团、酸牛奶和泡菜中的10株L.plantarum为研究对象,以其看家基因pheS和pyr G部分基因序列作为分子标记,结合已上传至Gene Bank的近缘种的相应序列构建系统发育树并与以16S rRNA基因构建的系统发育树进行比较。结果表明:基于16S rRNA基因序列不能区分L.plantarum及其近缘种,而看家基因pheS和pyr G部分基因序列能够很好的区分植物乳杆菌种及其近缘种,其中,pheS在植物乳杆菌种内分型时相较于pyr G基因效果更好,以及将pheS和pyr G部分基因序列串联使用后,试验菌株与参考菌株的分类关系更加明晰,因此,联合基因(pheS-pyr G)可作为16S rRNA基因的辅助工具用于L.plantarum及近缘种和植物乳杆菌种内分型的快速分类鉴定。     

应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析巴东地区豆瓣酱中微生物多样性

为了解湖北省恩施市巴东地区豆瓣酱中微生物的多样性,采用Illumina MiSeq高通量测序技术,分析豆瓣酱中细菌16S r RNA及真菌18S rRNAV4区基因序列,进而比较豆瓣酱微生物的群落结构组成及多样性差异。结果 3个样品共获得117644条有效序列,867个OTUs数目。多样性分析表明,豆瓣酱中具有高度的微生物群落多样性。微生物群落组成分析表明,样品中子囊菌门(Ascomycota,95.84%)、变形菌门(Proteobacteria,47.13%)、厚壁菌门(Firmicutes,32.37%)、放线菌(Actinobacteria,12.87%)为优势菌门,所占比例都超过了10.0%。在豆瓣酱样品中分别鉴定出311个细菌属和16个真菌属,优势细菌和真菌属平均相对含量分别为8.09%和24.74%,细菌及真菌多样性在属的水平上差异显著(p0.05)。研究结果加深了对豆瓣酱微生物群落组成和多样性的认识,以期为巴东地区豆瓣酱中微生物菌种资源的发掘与保护提供理论依据。     

利用16S rRNA序列鉴定分离自芽菜中的芽孢杆菌

从宜宾芽菜中分离优势菌群,选取4株芽孢杆菌,分别为B1、B2、B3、B4.对4株菌的16S rRNA基因经PCR扩增测序,将测序结果同该属内菌株的16S rRNA序列作多序列比较,并建立芽孢杆菌属的系统发育树.结合细菌形态学生理生化特性鉴定结果,结果表明菌株B1、B3为枯草芽孢杆菌,菌株B2为解淀粉芽孢杆菌,菌株B4为乙酰微小杆菌.     

A PCR method based on 16S rRNA sequence for simultaneous detection of the genus Listeria and the species Listeria monocytogenes in food products

The genus Listeria comprises six closely related species, of which only Listeria monocytogenes is a human pathogen. The rapid and sensitive detection of L. monocytogenes is important in the food industry as well as in medical diagnosis. In this study, a PCR-based method for the rapid, specific, and sensitive detection of L. monocytogenes in food products was developed. The PCR is based on DNA sequences and primer pairs that are found within the 16S subunit of the rRNA gene and are specific to the Listeria genus and to L. monocytogenes within the Listeria genus. The primers for the Listeria genus and for L. monocytogenes were used in the same reaction mix for their simultaneous detection. In addition, a pair of bacterial primers universal to any bacterial DNA at the 16S subunit of the rRNA gene were developed as a positive control. For the detection of Listeria and L. monocytogenes in food products, the method includes selective enrichment for Listeria followed by DNA extraction and a specific PCR reaction. The method detects 1 to 5 CFU in a 25-g sample in < or = 24 h. It can be easily incorporated into the routine screening of diverse food products and readily adapted for clinical use.     

花生青枯菌红安分离物的鉴定

从湖北红安发病花生根部分离到一个细菌分离物2C1,对该分离物进行了TZC显色反应,致病力的测定,16S rRNA、23S rRNA和鞭毛蛋白基因filC的PCR扩增,16S rRNA PCR扩增产物的序列分析。结果显示,分离物2C1在TZC培养基上表现出青枯菌的典型菌落形态,对花生具有强致病性,PCR扩增获得与预期大小的产物片段;16S rRNA核苷酸序列具有与其它青枯菌分离物99%左右的一致性。上述结果表明：2C1是具有强致病力的花生青枯菌分离物。