发酵液中牛肉风味肽分离纯化方法的比较研究

使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对重组酵母发酵液中一种牛肉风味肽（BMP）的稳定性进行了研究，并分别运用D301离子交换层析和Sephadex G-25凝胶过滤层析对其进行了分离纯化，最后利用RP-HPLC对目标肽进行分析检测。结果表明，在pH值为7．4条件下，发酵液中的目标肽于室温下放置0h-8h后仍呈现良好的稳定性。分离纯化结果显示，Sephadex G-25凝胶过滤层析的分离纯化效果优于D301离子交换层析，更适合于分离复杂体系发酵液中的风味肽。     

牦牛乳硬质干酪苦味肽的分离与特征鉴定

为了探究牦牛乳硬质干酪中苦味肽组成特征,采用氯仿-甲醇法提取苦味肽,通过Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化,并利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）对其分离的苦味较强组分进行特征鉴定。结果表明：经Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱分离得到3 个不同分子质量的组分,组分Ⅱ具有明显苦味。LC-MS/MS鉴定出组分Ⅱ中存在14 种苦味肽,主要为氨基酸残基数目7～17 个、分子质量小于2 000 D的小肽,苦味肽序列中存在的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸,800～1 500 D苦味肽占64.29%,源自β-酪蛋白（β-casein,β-CN）降解产物的苦味肽占92.86%。因此,干酪成熟过程中源自β-CN的具有较强疏水性、分子质量小于2 000 D的混合多肽的积累可能对干酪苦味的产生有较大影响。     

面筋蛋白咸味肽的分离纯化及结构鉴定

为了明确面筋蛋白酶解液中的咸味肽序列，对面筋蛋白咸味酶解物进行了分离纯化和结构鉴定。对酶解物脱盐处理后进行分离纯化。经过分级超滤，选择咸味最高、分子质量1 000 Da以下的组分进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤层析，结合感官评定结果筛选出咸味最强的组分，并利用液相色谱-串联质谱鉴定其氨基酸序列。最终得到面筋蛋白中咸味肽氨基酸序列为PFGQQ、PFSPQ、QPFP、PDFP、FDDP，分子质量分别为576.28、575.28、488.25、475.22、493.21 Da。本研究为面筋蛋白咸味肽的开发提供了一定理论依据。     

带鱼水解蛋白的酶法制备及其性质研究

采用复合酶(木瓜蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶)制备带鱼水解蛋白,并对其性质进行了研究.考察了水解时间、防腐剂、加酶总量、酶比例、温度、pH等因素对蛋白质水解度的影响;利用Sephadex G-75凝胶过滤层析,测定了水解产物的相对分子质量;利用氨基酸自动分析仪,对水解产物的氨基酸组成进行了分析.结果表明,在优化的水解条件下,水解度达27.36%;Nisin对水解度没有不利影响.水解产物的平均分子量为803Da,约由6.3个氨基酸残基组成.水解产物含有赖氨酸等必需氨基酸,含量占氨基酸总量的36.8%.低分子肽是带鱼水解蛋白的主要成分,构成肽的氨基酸占总氨基酸的比例为97.6%.     

带鱼水解蛋白的酶法制备及其性质研究

采用复合酶（木瓜蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶）制备带鱼水解蛋白,并对其性质进行了研究。考察了水解时间、防腐剂、加酶总量、酶比例、温度、pH等因素对蛋白质水解度的影响;利用Sephadex G-75凝胶过滤层析,测定了水解产物的相对分子质量;利用氨基酸自动分析仪,对水解产物的氨基酸组成进行了分析。结果表明,在优化的水解条件下,水解度达27.36%;Nisin对水解度没有不利影响。水解产物的平均分子量为803Da,约由6.3个氨基酸残基组成。水解产物含有赖氨酸等必需氨基酸,含量占氨基酸总量的36.8%。低分子肽是带鱼水解蛋白的主要成分,构成肽的氨基酸占总氨基酸的比例为97.6%。      

波纹巴非蛤生物活性肽的分离与提纯研究

以波纹巴非蛤为原料,根据最佳酶解条件制备酶解液。通过凝胶层析柱(Sephadex G-25)分离水解所得粗品波纹巴非蛤酶解液,并用紫外可见分光光度计测定收集后的各管溶液,然后根据各吸光度值绘制的管数-吸光度曲线图得出第三个峰附近的管数为小分子段。根据标准曲线计算出活性肽的分子量为753.58D,最后通过反相高效液相色谱-质谱联用技术测出活性肽的分子量为679.4D。     

坛紫菜降血压活性肽的分离纯化及分子质量测定

用AS.1398 中性蛋白酶酶解制备坛紫菜(Porphyra haitanesis)ACE 抑制肽,并经超滤膜、Sephadex G-15 凝胶层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化,纯化产物测定其氨基酸组成,并运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子质量。结果显示：坛紫菜酶解液经超滤分离获得分子质量小于2000D 的组分ACE 抑制活性最高,IC50 为0.73mg/mL;该组分进行Sephadex G-15 凝胶层析分离得6 个组分,组分E 的IC50 最小,为0.67mg/mL。组分E 经RP-HPLC 分离得峰6 对ACE 的抑制率最高,达到89.54%;峰6 再次过RP-HPLC,又洗出2 个蛋白峰,说明峰6 并不是单一物质,还需进行多次反复纯化。测定峰6 的氨基酸组成主要含有Tyr、Val 和Phe,同时采用MALDI-TOF-MS 分析发现有8 个主要的质子峰,信号最强的质子峰为m/z 861.17,有4 个峰聚集在m/z 860 左右,说明峰6 平均分子质量大约为860D,推算出紫菜降血压肽含有3 个Val、2 个Phe、1 个Tyr,N 端为Val,可能的排序顺序有18 种。     

电泳和层析方法对梅鱼蛋白酶解产物的分离分析

为了解梅鱼蛋白酶解产物的组成,用Sephadex G-10时梅鱼蛋白酶解液进行脱盐处理,再用常规SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE系统分析酶解液多肽的分子质量范围,并比较了Sephadex G-25和Sephadex G-50对粗酶液的分离效果.结果显示,当洗脱流速为1.52 mL/min时,Sephadex G-10对酶解液的脱盐效果较理想;用凝胶总质量浓度为160g/L、交联度5%的Tricine-SDS-PAGE系统分析酶解液的成分,其主要成分为分子质量小于14.4kDa的多肽;粗酶液在Sephadex G-25上的分离效果优于Sephadex G-50,得到4个较清晰的蛋白峰.     

河蚌酶解降血压肽的初步分离及性质研究

以酶解河蚌多肽为原料,对其中的降血压肽进行初步分离及性质研究.采用凝胶Sephadex G-50对河蚌酶解多肽进行分离纯化,得到2个组分MPP1和MPP2,其分子质量分别为14 125 Da和1 271 Da.用高效液相色谱(HPLC)测定血管紧张素转化酶(ACE)抑制率,其半抑制浓度(IC50)分别为0.88 mg/mL和0.32 mg/mL.其中,组分MPP2具有明显的降血压作用.对氨基酸组成的分析表明,MPP2中谷氨酸(Glu)含量最高,即14.04 g/100g;疏水性氨基酸含量高达29.76 g/100g,与其较高的降血压活性密切相关.     

金华火腿中小肽的分离纯化及结构研究

采用切流向过滤、葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤层析对成熟前和后熟结束时期金华火腿中小肽进行分离纯化。结合高效液相色谱-串联质谱仪进行分析,得到26种主要的小肽。其中有7种肽重现性较好,相对峰面积较高,其氨基酸序列分别为Ala-His、Pro-Leu、Ser-Gly-Val、Ser-Gly-Phe、Pro-Leu-Lys-Pro-Ala、Leu-Leu-Ala-His 和Asn-Pro-Thr,对应的相对峰面积分别为17.81%、8.62%、10.58%、5.70%、6.11%、6.12%和3.49%。     

肉源乳酸菌抑菌特性分析

为了筛选有抑菌活性的乳酸菌并分析其抑菌的物质基础,利用牛津杯琼脂扩散法,分析了19株从牧区风干肉制品中分离得到的肉源乳酸菌发酵上清液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力,同时从中分别选取对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制能力有显著差异的乳酸菌各3株,对其上清液中的抑菌物质基础和抑菌能力影响因素进行了分析。结果表明19株乳酸菌中菌株F19对大肠杆菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径为(15.07±0.55) mm,而F11发酵上清液对大肠杆菌完全没有抑制效果,菌株F16对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径为(14.47±0.38) mm,而F6、F2发酵上清液对金黄色葡萄球菌完全没有抑制效果;抑菌的物质基础分析表明,酸性环境在抑菌过程中占主导地位,细菌素与过氧化氢发挥协同作用;对其发酵上清液进行不同pH以及不同温度处理后发现,其抑菌活性在pH<5.0时随pH的降低而显著增强(P<0.05),当pH分别升高至5.0、6.0、7.0时试验乳酸菌发酵上清液均不具有抑菌能力,F18发酵上清液分别在60、80、100、121 ℃热处理一定时间后其抑菌能力与对照组相比仍然无明显差异(P>0.05),F11发酵上清液在100 ℃热处理30 min后抑菌能力显著减弱(P<0.05),其余实验菌株发酵上清液温度达到60 ℃以上,抑菌能力随热处理温度提高而显著(P<0.05)下降。本研究发现了乳酸菌发酵上清液的抑菌效果具有特异性,抑菌物质主要是酸性物质,其次是细菌素和过氧化氢;抑菌能力受pH和温度影响,同时具有特异性。研究结果可为优质菌种资源开发提供理论指导与技术支持。     

野生艾蒿浸提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用

利用水浸提法制得的艾蒿提取物采用滤纸片法和测OD值法对金黄色葡萄球菌进行抑菌活性实验研究。结果表明:艾蒿浸提物采用两种方法对金黄色葡萄球菌都有很好的抑制活性;且艾蒿提取物的抑菌效果与其自身浓度有关,高浓度的提取液抑菌作用强烈,反之则相对较弱。     

泥鳅ACE抑制肽的体外活性研究

以泥鳅蛋白为原料,酶解制备具有降血压活性的短肽,研究该肽的稳定性。在加热温度≤80℃条件下加热2h,泥鳅降血压肽（<2.5ku）的ACE抑制活性没有显著变化。当2.0≤pH≤8.0时,泥鳅降血压肽的ACE抑制活性变化不显著。冷冻干燥优于喷雾干燥。Mg2+对泥鳅降压肽的降压活性起到促进作用,而Zn2+和Mn2+抑制了肽的降压活性。葡萄糖对降压肽活性的影响程度明显大于蔗糖,随着浓度的升高,其ACE抑制活性逐渐降低,褐变程度加深;氯化钠对降压活性的影响不明显。在模拟胃肠道消化体系中,胃蛋白酶的消化显著提高了产物的降压活性;胰酶的消化降低了产物的降压活性。泥鳅多肽属于底物型ACE抑制肽。      

源于皱纹盘鲍裙边胶原蛋白ACE抑制肽的制备

为了提高皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)裙边的利用率,以其为原料纯化胶原蛋白,并通过胰蛋白酶和胃蛋白酶共酶解制备血管紧张素转换酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽。酶解液经超滤、Superdex^TM peptide10/300GL凝胶柱和高效液相色谱分离纯化,获得了3条来源于皱纹盘鲍胶原蛋白的肽段SGEVGQ、QRGPAGAQGPQ和GPPGPAGAR。其中结合能力最强的肽为GPPGPAGAR,对ACE的IC50值为177.1μmol/L,分子对接结果显示其主要作用于ACE的S1活性口袋,抑制模式与赖诺普利类似,并且经模拟胃肠液消化后仍能发挥较强的ACE抑制作用。本研究通过酶解皱纹盘鲍裙边胶原蛋白制备ACE抑制肽,为鲍鱼裙边的精深加工和ACE抑制肽的开发提供了参考。     

酸碱处理对酪蛋白源ACE抑制肽稳定性影响的研究

在不同pH值条件下,处理酪蛋白源ACE(血管紧张素转换酶)抑制肽,以ACE抑制活性、游离氨基质量浓度以及色差值为检测指标,研究了酸碱处理对ACE抑制肽稳定性的影响。结果表明,ACE抑制肽受酸碱度影响较大,pH值为1~8的ACE抑制肽的抑制活性维持在一个较高水平,平均抑制活性达到58.33%,pH值为9~13的样品抑制活性明显降低;游离氨基质量浓度在中性条件下较高,随着酸性和碱性条件的增强,其含量逐渐降低;另外,ACE抑制肽在pH<3和pH>11条件下,随酸性和碱性条件的增强,b*值变大,颜色变深。因此,在食品加工贮藏过程中,为使酪蛋白源ACE抑制肽保持活性稳定,应避免其处于过酸或过碱的加工条件。     

油菜蜂花粉ACE抑制活性酶解物的制备及分离

采用4 种蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白制备ACE 抑制活性物质,高效液相色谱法测定油菜蜂花粉蛋白水解物对ACE 的抑制率。结果表明：油菜蜂花粉蛋白酶水解物具有ACE 抑制活性,水解物对ACE 的抑制活性差异显著(P ＜ 0.05),其中碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶,碱性蛋白酶水解物的IC50 为0.35mg/mL。4 种蛋白酶水解物经Bio P-2 凝胶分离后,ACE 抑制活性较强的组分主要集中在保留时间70～120min,在此区间碱性蛋白酶水解物分离组分对ACE 的抑制率达到90% 以上,分子质量在376.4～1355D 之间。     

珍珠河蚌肉酶解制备ACE抑制肽研究

采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解珍珠河蚌肉,通过体外检测方法测定其ACE抑制率。结果表明,胃蛋白酶水解产物的ACE抑制率最大。采用四因素二次通用旋转设计对胃蛋白酶水解河蚌肉的水解条件进行优化,研究了酶与底物的质量比(E∶S)、温度、pH值和时间对水解产物ACE抑制率的影响,建立了回归方程,分析了各因素对ACE抑制率的影响,确定了最优的水解条件。     

ACE抑制肽构效关系研究进展

血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制肽是一类从食源性蛋白质中分离得到的具有降高血压活性的多肽。由于其降血压效果好,而且没有降压药物的毒副作用从而引起了广泛关注。近年来,ACE抑制肽的构效关系研究成为研究重点。结构生物信息学研究表明,ACE抑制肽的ACE抑制能力不仅与其分子质量有关,而且与其氨基酸序列以及其立体空间构象之间存在高度相关性。ACE抑制肽的抑制类型与ACE抑制活性、构效关系也存在一定相关性。对ACE抑制肽构效关系进行深入研究将有助于指导开发高活性的功能性食品及降血压药物。     

The impact of fermentation and in vitro digestion on the formation of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity from pea and whey protein

Pea and whey protein were fermented by Lactobacillus helveticus and Saccharomyces cerevisiae in monoculture and in combination at 28 and 37 degrees C in order to release angiotensin-I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides. The fermentation products were subjected to in vitro gastrointestinal digestion, and the digests of nonfermented samples served as controls. After fermentation, the ACE inhibitory activity (%) increased by 18 to 30% for all treatments, except for the fermentations of whey protein with Saccharomyces cerevisiae at 28 degrees C, where no significant change was observed. After digestion, however, both fermented and nonfermented samples reached maximum ACE inhibitory activity. The whey digests tended to have lower (50%) inhibitory concentrations (IC50; 0.14 to 0.07 mg/ml), hence, higher ACE inhibitory activity, than the pea digests (0.23 to 0.11 mg/ml). The nonfermented whey protein digest showed the highest ACE inhibitory activity of all. For pea protein, the nonfermented sample had the lowest IC50 value. These results suggest that in vitro gastrointestinal digestion was the predominant factor controlling the formation of ACE inhibitory activity, hence, indicating its importance in the bioavailability of ACE inhibitory peptides.     

Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of water-soluble extracts of Asiago d'allevo cheese

The angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory activity of water-soluble extracts (WSE) from Asiago cheeses was assayed in two cheese production systems and with different ripening times. The WSE were ultrafiltered through 10 kDa and 3 kDa cut-off membranes to evaluate the ACE inhibitory activity of long and short peptides, respectively. The cheese production systems had no significant effect on the ACE inhibitory activity, whereas 6-month-old cheeses had higher inhibitory potency than the more ripened ones. Moreover, the fraction containing peptides smaller than 3 kDa made a more considerable contribution to ACE inhibitory activity than the fraction smaller than 10 kDa, suggesting an inhibitory effect due to short peptides. The peptidic fraction was characterized using RP-HPLC coupled to mass spectrometric detection. Simulated gastrointestinal digestion was carried out to evaluate the effects of digestive enzymes on the generation of bioactive peptides, but this did not significantly affect the inhibitory activity.