海产品中副溶血性弧菌免疫磁分离和环介导等温扩增快速检测方法的建立

采用纳米免疫磁珠分离副溶血性弧菌,建立副溶血性弧菌环介导等温扩增检测方法。方法 采用副溶血性弧菌单克隆抗体,制备纳米免疫磁珠,特异性吸附副溶血性弧菌,结合环介导等温扩增技术,建立副溶血性弧菌快速检测方法。结果 副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为10³cfu/ml水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。免疫磁分离结合环介导等温扩增技术,在纯培养、无需增菌情况下,检测灵敏度达到140cfu/ml增菌液;通过对134株副溶血性弧菌和74株非目标菌的测试,环介导等温扩增技术具有良好的特异性;食品基质添加试验中,在增菌时间缩短至8h的条件下,其检测限为2cfu/25g样品。结论 副溶血性弧菌免疫纳米磁珠结合环介导等温扩增技术,有效缩短了增菌时间,适用于副溶血性弧菌的快速检测。     

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法.本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价.利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性.将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获.结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体.制备的免疫磁珠捕获率在55％ ～70％之间,且稳定性较好,盐离子浓度(3.5％ NaCl、4.5％ NaCl)对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小.在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度.免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景.     

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134 株副溶血性弧菌和74 株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。     

基于时间分辨纳米荧光微球的免疫层析技术快速检测副溶血性弧菌

由副溶血性弧菌引起的食品中毒事件频繁爆出,开发一种简单、快速且能大规模现场检测的方法对确保食品安全、避免经济损失具有重要意义。该研究成功开发了针对副溶血性弧菌现场快速检测的时间分辨荧光免疫层析技术（TRF-LFIA）。该方法将时间分辨纳米荧光微球（EuNPs）标记副溶血性弧菌单克隆抗体形成可以作为特异性免疫荧光探针的微球抗体偶联物,通过测定探针与目标致病菌结合后的荧光信号值来实现对目标致病菌的定量检测。该研究开发的TRF-LFIA方法对副溶血性弧菌检测的灵敏度为8.2×102 CFU/mL,视觉检测限为1.2×104 CFU/mL,线性范围为1.8×103~1.8×107 CFU/mL,回收率为84.25%~105.13%,变异系数（CV）为2.56%~9.14%,并且对其他7种主要食源性致病菌株检测未发生交叉反应。该研究所建立的TRF-LFIA检测方法具有灵敏度高,操作简单、快速,重复性、特异性好等优点,为针对副溶血性弧菌的现场快速检测提供了一种有力的检测工具。     

磁性荧光纳米颗粒标记免疫层析技术检测副溶血性弧菌热稳定直接溶血素的试验研究

目的通过抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒相结合的免疫层析技术,建立一种快速检测产热稳定直接溶血素(TDH)副溶血性弧菌的方法。方法构建产TDH副溶血性弧菌基因片段并进行扩增,扩增产物与质粒载体(p ET-28a)连接,并在大肠埃希菌中表达,制备抗体。抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒偶联后,制成免疫层析检测试纸条。将混有不同浓度标准菌株样品和阴性对照样品分别与荧光纳米颗粒-单抗偶联物和试纸条共同反应5min,紫外光下肉眼观察结果。对试验的敏感性、特异性、重复性进行测试并进行样品模拟试验。结果重组质粒载体在大肠埃希菌BL21(DE3)可稳定高效地表达分子量为26 k D的可溶形式的目的蛋白,并实现了单克隆抗体与磁性荧光颗粒很好的偶联,所得偶联物与最低浓度10 CFU/ml阳性菌株反应,阴性对照菌株无反应。结论试验制备的产TDH副溶血性弧菌毒力基因表达产物与磁性荧光纳米颗粒有机结合,检测操作过程简单,具有灵敏度高、特异性强、重复性好和检测时间短等特点。     

副溶血性弧菌单克隆抗体的制备及特性鉴定

为制备特异性强的副溶血性弧菌的单克隆抗体,解决单克隆抗体对免疫学检测产品研发的制约,以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC 17802标准菌株免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、间接酶联免疫吸附测定法筛选,获得稳定分泌抗副溶血性弧菌(ATCC 17802)菌株的单克隆杂交瘤细胞株3F7D7E8C4,通过体内诱生腹水大量制备抗体,用亚类试剂盒测定抗体亚类为Ig G1;采用辛酸硫酸铵沉淀法以及亲和层析柱对腹水进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳实验鉴定单克隆抗体的纯度。制备得到腹水抗体效价为1∶16 000,纯化后抗体效价为1∶8 000,抗体敏感性IC_(50)达到10~6 CFU/m L。纯化后的抗体与12株副溶血性弧菌均能特异性结合,与其他9种非副溶血性弧菌的食源性致病菌均无交叉反应。     

水产品中副溶血性弧菌快速检测技术研究进展

副溶血性弧菌广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼虾、贝类等海产品中,是一种重要的食源性致病菌。在我国沿海地区,由副溶血性弧菌引发的食品安全事件数量已经跃升食品中毒事件的首位。因此,为了提高水产品中副溶血性弧菌的检出准确率,降低食物中毒的风险,有必要建立快速、准确、灵敏的检测副溶血性弧菌的方法。目前,除了传统的检测方法外,分子生物学和免疫学等快速检测方法已成为副溶血性弧菌的主流检测技术。本文主要综述了分子生物学和免疫学快速检测方法在副溶血性弧菌检测中的应用现状,并对未来的发展前景作了展望。     

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)鞭毛蛋白FlaA的重组表达与多克隆抗体制备

副溶血性弧菌是广泛存在于水产品中的革兰阴性致病菌。鞭毛蛋白FlaA是副溶血性弧菌的一种特异性的蛋白质,以该蛋白质作为抗原所制备到的抗体可以作为检测副溶血性弧菌的探针。该研究通过分子生物学方法构建了重组FlaA的表达载体pET28a-flaA,并采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导实现FlaA的大量表达。该重组蛋白以可溶性形式存在,经Ni-NTA亲和柱纯化后对家兔进行免疫,得到浓度为24.32 mg/mL、效价为1∶125,000的抗FlaA抗体。通过间接ELISA实验,测得该抗体与副溶血性弧菌反应的灵敏度为1.0×104CFU/mL,且该抗体与5种其他常见致病菌无明显交叉反应。     

基于近红外免疫层析技术的食源性副溶血弧菌快速检测方法研究

建立一种应用近红外荧光免疫层析技术快速检测副溶血弧菌的方法。采用近红外荧光标记副溶血弧菌单克隆抗体,将副溶血弧菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制检测副溶血弧菌的近红外免疫层析试纸条及配套标准物质。研究表明,所建立的近红外免疫法对检测副溶血弧菌具有良好的特异性和较高的灵敏度,最低检测限为1.2×10~2 CFU/mL,与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌无交叉反应。通过效果评价试验发现,与传统检测方法相比较,所建立的近红外荧光法检测时间时间最短,检测限与RT-PCR法接近。近红外荧光法在45 min内即可完成检测,可用于食品中副溶血弧菌的高效检测,为食品安全监管提供可靠的技术支持。     

基于微间隙阵列电极传感器检测副溶血性弧菌的方法初探

目的建立电化学免疫传感器法快速检测副溶血性弧菌的分析方法。方法采用微间隙阵列电极作为基础电极,运用双抗夹心酶联免疫反应和酶催化银沉积反应实现分析信号放大,检测副溶血性弧菌。结果该方法特异性良好,对非目标菌株无交叉反应,对副溶血性弧菌的检出限为10~5 CFU/mL,线性范围为10~5~10~8CFU/mL,传感器的电导率与副溶血性弧菌浓度之间呈良好的线性关系,线性相关系数r~2=0.955。增菌6h后,只需2h即可完成检测。结论该方法具有检测速度快、操作简便、检测成本低等特点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了一种有效手段。     

食源性副溶血性弧菌的检测方法研究进展

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种食源性致病菌,由其引发的食品安全事件已跃居我国食源性致病菌中毒数量首位。目前检测食品中致病微生物的方法主要有:传统生化培养方法、以抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法、以PCR为基础的DNA分子检测方法等。本文总结了当前VP主要检测方法,包括免疫磁珠分离、酶联免疫吸附反应、免疫层析测试、免疫传感器、PCR技术、环介导等温扩增技术、DNA适配体传感器、DNA杂交技术等,以期为VP的快速检测方法提供借鉴和参考。     

荧光分析在食品安全快速检测中的应用

近年已发展了多种快速检测食源性微生物的方法,其中荧光分析结合免疫技术和PCR技术在食品安全快速检测中具有快速、简单、灵敏等特点。主要就几种常见食源性病原菌：沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、李斯特氏菌、禽流感病毒等快速检测中的应用进行了综述。     

食品中单增李斯特菌的检测新技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,可使人畜患脑膜炎、心肌炎、败血症、死婴、早产等疾病,危害较大;有效控制食品中的LM,是食品安全的重要课题之一。对以免疫学、分子生物学为基础建立的一些方法,如酶联免疫吸收分析法(ELISA)、酶联荧光分析法(ELFA)、DNA探针、PCR、DNA微矩阵法,作一简单叙述,为深入研究提供参考。最后指出预防手段非常重要,从源头上杜绝LM污染是关键。     

单增李斯特菌检测技术研究进展

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种人畜共患食源性致病菌,可使人畜患脑膜炎、心肌炎、败血症、早产等疾病,危害较大。有效控制食品中的单增李斯特菌,是食品安全的重要课题之一。本文对单增李斯特菌的主要检测技术,如传统分离鉴定、免疫法、分子生物学法、全自动微生物分析系统、生物传感器检测作了简要叙述,为深入研究提供参考。并对我国单增李斯特菌的检测监控进行了展望。     

免疫学法检测黄曲霉毒素的研究进展

黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的次生代谢产物,是世界卫生组织公认的致癌物。目前,对黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法和酶联免疫吸附法等,其中免疫化学方法具有特异性强、灵敏度高和快速简便等优点,在黄曲霉毒素的检测中应用广泛。建立快速、简便和无毒的检测体系将成为今后检测AFT的研究热点。     

食源性致病菌免疫学检测方法研究进展

食源性致病菌广泛存在,因其能引起人的疾病甚至死亡,而越来越受世界各国的关注。食源性致病菌传统检测方法为培养法,其费时耗力,不适用于快速检测。本文介绍的免疫学方法具有方便、快速等优点,因而越来越被广泛应用。免疫学检测方法主要有酶联免疫吸附法、免疫层析法、免疫磁珠分离技术、化学发光免疫分析法和乳胶凝集法等。本文着重对这些方法的原理及其应用进行综述,阐述其优缺点,同时对免疫学检测方法未来的发展趋势进行了展望。     

食源性致病菌快速检测研究进展

系统地介绍了几种食源性致病菌快速检测方法。如免疫学检测、生物学检测、代谢学检测等方法以及这几种检测方法的发展方向。     

食品中沙门氏菌快速检测技术研究进展

沙门氏菌的检验在食品微生物检验中具有十分重要的意义。本文主要针对基于免疫学的快速检测方法-酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、基于分子生物学的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和基于蛋白质的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在食品中沙门氏菌快速检测的应用进行了分析与比较。基于3种不同原理的检测方法各有其优缺点,ELISA方法成本低,操作简单但检出限高;PCR方法成本较高,但检测快速、灵敏度高且检出限低;MALDI-TOF MS检出限低但需要完善的细菌库进行比对。因此建议将含内控的荧光定量PCR与LAMP法作为食品中检测沙门氏菌的主要方法。     

污染粮油食品的主要真菌毒素及胶体金免疫层析技术在快速检测中的应用

污染粮油食品的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素B1。胶体金免疫层析技术是20世纪90年代初建立的一种简易、快速的免疫学检测技术,现已广泛应用于残留检测、生物医学等许多领域。本文介绍了污染粮油食品的主要真菌毒素及胶体金免疫层析技术在粮油食品真菌毒素快速检测中的应用,并对其发展前景进行了展望。     

食源性致病菌单增李斯特菌检测技术的研究进展

单增李斯特菌是一种兼性厌氧性食源性致病菌,对低温、高盐及消毒剂的抵抗力很强,感染后可能产生低热、高热或其他全身性疾病,免疫力低下的人可能会引起肠胃炎、孕妇流产、早产或死产,甚至会产生脑膜炎。LM的传统检测方法是先进行增菌,再经过氧化氢酶试验、溶血试验、血清学试验等进行鉴定,操作性强、灵敏度高、成本低,但是检测周期长达7 d,无法对目标食物进行快速检测。本文综述了振动光谱学检测方法、免疫学检测方法、分子生物学检测方法、代谢组学检测法、生物传感器等食源性单增李斯特菌的检测方法,并比较其优缺点,以期为食品中LM的快速检测方法的研究提供参考。