内蒙古锡林郭勒盟地区传统奶油制品中产共轭亚油酸乳酸菌的分离筛选与鉴定

本实验从内蒙古锡林郭勒盟地区传统奶油制品中分离筛选共轭亚油酸（conjugated linoleic acid,CLA）高产乳酸菌。采用紫外分光光度法检测菌株发酵液中CLA含量,筛选出高产菌株,分析其菌落特征、细胞形态及生理生化特性,并结合16S rDNA全序列分析以及系统发育树,鉴定其种属。结果表明,从样品中共筛出20 株产CLA菌株,当亚油酸（linoleic acid,LA）添加量为0.06%,接种量为2%时,分离自镶黄旗酸油的11 株产CLA菌株中,菌株HS4产量最高,为23.586 μg/mL,转化率为7.86%,经鉴定其为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）;分离自正镶蓝旗稀奶油的9 株产CLA菌株中,菌株LX5产量最高,为20.508 μg/mL,转化率为6.84%,经鉴定其为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。     

定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

为获得高产共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的菌株，对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原（myosin-cross-reactive antigen，MCRA）基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆，克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构建两种含mcra基因和lai-p基因的大肠杆菌重组菌株，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导阳性重组菌蛋白表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白表达条带，说明两种基因表达成功。采用易错聚合酶链式反应定向进化mcra基因和lai-p基因，构建重组菌突变体库，利用流式细胞术分选获得吸光度提高和CLA产量提高的重组菌株，其中pCold-ycmcra-gfp重组菌243 株，吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4，提高了5.02 倍；pCold-yclai-p-gfp重组菌156 株，产量最高的为39号菌（11.62±0.003 6）μg/mL，提高了2.99 倍。本研究为后期深入了解突变菌株CLA产量提高的原因，并获得两种亚油酸异构酶的产酶机制奠定了一定基础。     

植物乳杆菌p-8转化亚油酸为共轭亚油酸的分析

研究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）p-8的菌体、菌体破碎液和重组亚油酸异构酶系转化亚油酸（linoleic acid,LA）为共轭亚油酸（conjugated linoleic acid,CLA）的能力和机制。结果表明：L. plantarum p-8在含有LA的MRS上清液和菌体破碎液体外催化LA时,都可以低效产生cis9,trans11-CLA（c9,t11-CLA）、trans10,cis12-CLA（t10,c12-CLA）和trans9,trans11-CLA（t9,t11-CLA）,但菌体中只有很少的t10,c12-CLA。实时聚合酶链式反应结果表明,亚油酸异构酶系的表达水平较低可能是CLA产量较低的原因。独立表达的重组亚油酸异构酶系成员、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin denine dinucleotide,FAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸都存在才可完成LA转化为c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA,转化途径与L. plantarum AUK1009一致。L. plantarum p-8的亚油酸水合酶经同源建模后有3 个结构域,底物结合位点与FAD位点位于3 个结构域连接处的疏水空腔中,M76和Y180是2 个必需基团。     

一株嗜酸乳杆菌产共轭亚油酸条件的优化

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是具有抗癌、减肥等许多生理功能的天然脂肪酸.生物法合成共轭亚油酸无毒且异构体单一,但目前产量较低.为提高CLA产量,以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为出发菌株,优化其培养条件.结果表明:发酵液初始pH为6.5,红花油添加量为0.15%,接种量5%,发酵温度为37°C,发酵时间为60h时最有利于共轭亚油酸的合成,此时CLA的合成最为94.7μg/mL.     

牛乳中高产共轭亚油酸乳酸杆菌的研究

以云南7个地区的牛乳、水牛乳样品中分离的40株乳酸杆菌为基础,以亚油酸为发酵底物,利用紫外分光光度法对共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)产生菌进行筛选;利用气相色谱法检测高产菌株中CLA的主要异构体及各组分所占比例。本研究得到5株CLA产生菌:M2、M9、M16、M25、M28,产量分别为:25.54、34.56、15.48、20.46、14.79μg/mL,其中菌株M9为CLA高产菌株;气相结果显示菌株M9中CLA的主要异构体为:C18∶2 9c,11t;与对照组相比,油酸、亚油酸和C18∶2 9c,11t的含量变化表明菌株产生C18∶2 9c,11t与油酸和亚油酸有关。本研究为产CLA乳酸菌的筛选和CLA的产生原因提供了科学依据。     

共轭亚油酸合成相关基因在耶氏解脂酵母中异源表达及活性研究

为了探究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中与共轭亚油酸(CLA)生物合成相关的3个基因:(亚)油酸水合酶基因(mcra)、短链脱氢酶/氧化还原酶基因(dh)、乙酰乙酸脱羧酶基因(dc)在耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica,Y.lipolytica)中异源表达后能否具有活性,利用两个耶氏解脂酵母整合表达质粒(p INA 1269和p INA 1312),将3个基因分别导入耶氏解脂酵母营养缺陷型宿主菌Polf(Ura~-,Leu~-)中,构建了重组菌株。在不同重组菌中添加相应的底物:亚油酸(LA)和10-羟基-顺12-十八碳烯酸(10-HOE),然后对反应体系进行脂肪酸检测,得到基因对应的不同产物:10-HOE和10-氧代-反11-十八碳烯酸(10-oxo-trans 11-octadecenoic acid),证明mcra、dh、dc在耶氏解脂酵母中进行了异源表达并且具有活性。     

乳酸菌制备CLA的研究

我们利用从酸菜汁中分离出的一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarumL18转化亚油酸(LA)来制备共轭亚油酸(CLA)。在MRS培养基中添加0.06%(wt/vol)的LA作为诱导剂,获得制备CLA的洗涤细胞。以游离LA为底物,植物乳杆菌Lactobacillus plantarumL18的洗涤细胞为催化剂,厌氧环境有利于生成CLA。0.1M的磷酸钠缓冲液、pH7.0、LA浓度2%(wt/vol)、细胞浓度为20%(wt/vol)、30℃,反应64h,CLA的产量最高。反应液中生成的CLA产物为c9,t11/t9,c11-CLA和t10,c12-CLA异构体的混合物。     

应用体外重组PCR技术构建Ppdc-ldh融合基因

利用重组PCR技术连接分别从干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ATCC334中扩增的乳酸脱氢酶基因（ldh）和运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）CP4中扩增的丙酮酸脱羧酶基因启动子（Pp出）片段,构建了Ppdc-ldh融合基因。并将其克隆到pMD19-T载体上,再转化到大肠杆菌DH5α中,得到阳性克隆质粒pT—Ppdc—ldh。序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框,具有起始密码子GTG和终止密码子TAA,启动子的-35区和-10区序列与起始密码子之间的距离没有改变,可以插入到原核表达载体中进行表达。     

产亚油酸异构酶的乳酸菌的筛选

对16株乳酸菌产亚油酸异构酶(linoleate isomerase)的能力进行分析,紫外分光光度法和气相色谱法分析发酵液中的共轭亚油酸(CLA),筛选出产亚油酸异构酶的乳酸菌,PCR扩增筛选出菌株的亚油酸异构酶基因,并对其进行序列分析.结果显示,通过紫外分光光度法检测16株乳酸菌中有9株菌可将亚油酸(LA)转化为共轭亚油酸(CLA);气相检测6株乳酸菌的发酵液中存在cis-9,trans-11 CLA和trans-10,cis-12 CLA两种同分异构体(各占CLA总产量的50％);成功扩增出鼠李糖乳杆菌与亚油酸异构酶密切相关的肌球蛋白交叉反应抗原(MCRA)基因片段.     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

人甲胎蛋白 AFP 在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

Production of free conjugated linoleic acid by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei of human intestinal origin

A gas chromatographic procedure was used for analysis of conjugated linoleic acid (CLA) isomers cis-9, trans-11-octadecadienoic; trans-10, cis-12 octadecadienoic; and trans-9, trans-11-octadecadienoic (c9t11, t10c12, t9t11) produced by lactobacilli. Four different cultures, two strains each of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei were tested for their ability to produce CLA from free linoleic acid in MRS broth supplemented with linoleic acid. Different concentrations of linoleic acid (0, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.5 mg/ml) were added to MRS broth, inoculated with the lactobacilli, and incubated at 37 degrees C. Viable counts and amounts of individual isomers of CLA (c9t11, t10c12, t9t11) were measured at 0, 24, 48, and 72 h. All the cultures were able to produce free CLA in media supplemented with linoleic acid. Maximum production of CLA (80.14 to 131.63 microg/ml) was observed at 24 h of incubation in broth containing 0.02% of free linoleic acid. No significant (P > 0.05) increases in total CLA levels were observed after 24 h of incubation. The ability of the cultures to produce CLA in skim milk supplemented with 0.02% free linoleic acid also was studied. In this medium, the total amounts of free CLA after 24 h of incubation ranged from 54.31 to 116.53 microg/ml. The use of lactic acid bacteria able to form free CLA in cultured dairy products may have potential health or nutritional benefits. Free CLA in the products likely would be more readily available for absorption from the digestive tract than if it were incorporated into the cells of the starter culture.     

异淀粉酶产生菌的分离鉴定及异淀粉酶基因的克隆表达

目的:为了进一步提高淀粉的利用率,从微生物中获得高产量异淀粉酶的菌株。方法:本实验从富含淀粉的土壤中筛选出1株高产异淀粉酶的菌株,命名为LZ-5,通过菌落形态观察、生理生化特性实验、16S rDNA序列及gyrB基因分析,构建系统发育进化树并对其进行鉴定;根据NCBI上的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)异淀粉酶基因设计引物,扩增出异淀粉酶基因后,以pMD-18T为载体,构建重组质粒,导入到E.coli DH5a感受态细胞,挑选阳性重组质粒进行酶切鉴定及表达产物的检测。结果:LZ-5鉴定为枯草芽孢杆菌,所产异淀粉酶酶活力为10.9 U/mL;测序结果与NCBI上报道的异淀粉酶基因相似度达到96%,表明将枯草芽孢杆菌的异淀粉酶基因成功转化到大肠杆菌中。经IPTG诱导表达,构建的大肠杆菌工程菌,通过细胞破碎仪破碎后,测得异淀粉酶酶活力为28.4 U/mL,是菌株LZ-5的2.6倍。结论:细菌异淀粉酶基因重组表达是解决异淀粉酶活力低的主要策略之一。     

谷氨酸棒杆菌argB基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的初步研究

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032序列，设计并合成一对引物，利用温度梯度PCR仪，获得了argB基因全长。将其克隆到pGEM-T-Easy载体中，经测序鉴定后定向克隆至表达载体pGEX-4T-1中，构建了pGEX-argB表达质粒。     

表达外源谷氨酸脱羧酶基因对重组乳酸乳球菌胁迫抗性的影响

通过在乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）NZ9000外源添加一定浓度的γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）和表达可以合成GABA的谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）两种方式,研究L. lactis NZ9000在酸胁迫和冷冻胁迫下的表现。结果表明：外源添加GABA的手段对于L. lactis NZ9000在酸胁迫和冷冻胁迫下的生长没有明显帮助。与之相反,通过逆转录-聚合酶链式反应克隆茶树中的CsGAD,构建pNZ8148-CsGAD表达载体,可获得高效表达GAD的基因工程重组菌L.?lactis?NZ9000/pNZ8148-CsGAD。经2?ng/mL乳酸链球菌素（Nisin）诱导8?h后,高效液相色谱检测表明重组菌合成GABA能力提高5?倍以上。生长曲线测定结果表明,正常培养条件下,重组菌到达对数生长平台期的时间较对照菌延长,到达稳定期的最大生物量（OD600?nm）提高至对照菌的1.5?倍;在pH?4.0的酸性培养条件下,对照菌基本不生长,而重组菌仍保持一定的生长力。低温胁迫实验结果表明,培养至稳定期后期的乳酸菌抗冻能力和存活率均要高于对数期中期和稳定期前期2?个培养阶段,且不同培养阶段中,重组菌的存活率均高于对照菌1～2?个数量级。综上所述,重组的L.?lactis?NZ9000/pNZ8148-CsGAD能够通过食品级异源表达CsGAD产生的GABA显著提高乳酸菌抗酸和抗冷冻胁迫的能力。本研究为探索研究乳酸菌抗胁迫机理、改良乳酸菌生长状态以利于其工业化用途的扩展提供了参考。