不同钙离子浓度体外条件下磷酸化对肌联蛋白降解的影响

以羊背最长肌中肌联蛋白为原料,添加蛋白激酶A和碱性磷酸酶体外孵育使肌联蛋白发生磷酸化和去磷酸化反应。反应后添加μ-钙蛋白酶,在钙离子浓度分别为0.05 mmol/L和2 mmol/L条件下,4 ℃孵育2 d。测定孵育体系pH值、肌联蛋白磷酸化水平及其降解程度。结果表明：不同处理组孵育体系pH值差异不显著（P＞0.05）;蛋白激酶A组肌联蛋白磷酸化水平显著高于对照组,对照组肌联蛋白磷酸化水平显著高于碱性磷酸酶组（P＜0.05）;当钙离子浓度为0.05 mmol/L时,蛋白激酶A组和对照组未检测到分子质量为1 200 kDa的降解条带,而碱性磷酸酶组在孵育12 h检测到该条带;当钙离子浓度为2 mmol/L时,蛋白激酶A组和对照组均在孵育12 h检测到1 200 kDa降解条带,而碱性磷酸酶组在孵育0.5 h时检测到该条带。结论：蛋白激酶A和碱性磷酸酶能够促进肌联蛋白发生磷酸化和去磷酸化反应;随着钙离子浓度增加,肌联蛋白降解速率加快;并且在相同钙离子浓度下,肌联蛋白在碱性磷酸酶组降解较快,表明去磷酸化可以促进肌联蛋白的降解。     

温度、pH值对离体模型中肌原纤维蛋白去磷酸化反应的影响

研究温度（25、15 ℃和4 ℃）和pH值（5.2、5.8、6.4）对碱性磷酸酶活性及催化去磷酸化反应能力的影响,为改善肉品质提供理论依据。提取宰后羊肉中的肌原纤维蛋白建立离体模型,添加碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Pro-Q Diamond磷酸化蛋白染色和SYPRO Ruby全蛋白染色测定肌原纤维蛋白磷酸化水平,试剂盒测定碱性磷酸酶活性。结果表明,随着孵育时间延长,pH 5.8和pH 6.4条件下碱性磷酸酶组肌原纤维蛋白磷酸化水平显著下降（P＜0.05）,pH 5.2条件下碱性磷酸酶组肌原纤维蛋白磷酸化水平无显著变化（P＞0.05）。对照组肌原纤维蛋白磷酸化水平在整个孵育期间无显著变化（P＞0.05）;4 ℃、pH 5.2条件下显著抑制（P＜0.05）碱性磷酸酶活性,使其催化去磷酸化时间延迟。测定碱性磷酸酶磷酸化水平发现,碱性磷酸酶不仅可以催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应,也能催化其自身发生去磷酸化反应,且碱性磷酸酶自身发生去磷酸化后不会失活。因此在一定范围内升高温度和pH值会提高碱性磷酸酶催化底物去磷酸反应的能力,降低磷酸化水平,且使去磷酸化时间提前,为改善肉品质及肉贮藏提供新思路。     

肌动球蛋白磷酸化对其解离的影响

目的:研究改变肌动球蛋白粗提物磷酸化水平对其解离程度及ATPase活性的调控作用。方法:以肌动球蛋白粗提物为材料,添加蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)改变蛋白的磷酸化水平(4℃孵育48 h),通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光染色、蛋白质免疫印迹、ATPase活力测定试剂盒测定蛋白的磷酸化水平、游离肌动球蛋白含量和肌动球蛋白ATPase活力随孵育时间的变化。结果:PKA处理组蛋白样品中的肌钙蛋白T和肌球蛋白调节轻链的磷酸化水平显著高于对照组(P0.05),游离肌动蛋白含量显著高于对照组,且在0~2 h显著升高,2~48 h缓慢升高;肌动球蛋白ATPase活力显著低于对照组(P0.05),其活力随孵育时间延长显著升高(P0.05);AP处理组的变化则与之相反。结论:肌钙蛋白T、肌球蛋白调节轻链的磷酸化降低了肌球蛋白与肌动蛋白之间的相互作用力(肌动球蛋白ATPase活力低),从而促进肌动球蛋白的解离。     

PSE猪肉肌原纤维蛋白的氧化变性

为探讨白肌肉(pale,soft and exudative meat,PSE肉)形成时肌原纤维蛋白结构和功能的变化,以PSE猪肉为研究对象,从氧化还原体系失衡和钙激活蛋白酶活性变化两方面进行研究。结果表明:与正常肉(red,firm and non-exudative meat,RFN肉)相比,PSE肉的超氧化物歧化酶抑制率显著降低(P0.05),谷胱甘肽过氧化物酶活性显著增加(P0.01),钙激活蛋白酶活性显著增加(P0.05);随着氧化还原体系失衡和钙激活蛋白酶活性的增加,PSE肉十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱的肌间线蛋白、肌动蛋白和Ⅰ-肌钙蛋白条带变淡、变细;肌原纤维蛋白的表面疏水性显著增大(P0.05),溶解性显著降低(P0.01),结构和功能特性发生改变。     

藏羊肉宰后成熟过程中热休克蛋白27对肌原纤维蛋白及细胞凋亡酶的影响

为研究藏羊肉宰后成熟过程中热休克蛋白27(heat shock protein 27,Hsp27)对肌原纤维蛋白降解特性及细胞凋亡酶活力的影响,以经Hsp27抑制剂KRIBB3处理的藏羊肉为研究对象,测定藏羊肉在宰后成熟过程中Caspase-3、Caspase-9活力变化以及肌原纤维蛋白的溶解性和降解特性,并通过体外实验进一步研究Hsp27对μ-钙激活酶和Caspase-3降解肌原纤维蛋白的影响。结果表明:Hsp27能显著抑制Caspase-3、Caspase-9的活力(P0.05),并能够抑制肌原纤维小片化的发生以及肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解;体外实验发现,Hsp27能够抑制μ-钙激活酶和Caspase-3对肌原纤维蛋白的降解。     

梅山猪与三元杂交猪肌内脂肪含量、μ-钙蛋白酶和蛋白降解对嫩度的影响

目的:比较梅山猪与三元杂交猪(杜洛克猪×长白猪×大白猪)的剪切力、肌内脂肪含量、μ-钙蛋白酶及蛋白降解的差异,分析影响梅山猪肉嫩度的因素。方法:选取6头纯种梅山猪和6头三元杂交猪,取背最长肌为实验材料,采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹技术测定μ-钙蛋白酶在宰后45 min的降解和整联蛋白、伴肌动蛋白在宰后成熟1、3、7 d的降解情况。结果:梅山猪肉在宰后成熟1、3、7 d的剪切力值均显著低于三元杂交猪(P0.05),在宰后成熟1 d的肌内脂肪含量显著高于三元杂交猪(P0.05)。在宰后45 min,梅山猪的μ-钙蛋白酶的80 kD百分含量显著高于三元杂交猪,78 k D和76 kD百分含量显著低于三元杂交猪(P0.05),梅山猪的μ-钙蛋白酶的自我降解程度较低,这与梅山猪的蛋白降解情况相一致。梅山猪的整联蛋白在成熟3d的相对光密度值显著高于三元杂交猪(P0.05),宰后成熟3 d和7 d的降解率显著低于三元杂交猪(P0.05),伴肌动蛋白在成熟1 d和3 d的相对光密度值显著高于三元杂交猪(P0.05)。结论:梅山猪的整联蛋白和伴肌动蛋白降解较少,这与μ-钙蛋白酶的降解有关,而μ-钙蛋白酶和蛋白降解对梅山猪肉的嫩度影响不大,梅山猪肉相对较高的肌内脂肪含量解释了其较高的嫩度。     

宰后不同成熟时间对羊肉肌原纤维蛋白降解及钙激活酶活性变化的影响

选择新疆巴什拜羊背最长肌为试验材料,分别在4℃下成熟1、3、7、14、21 d后测定分析其中肌原纤维蛋白、肌间线蛋白(Desmin)、肌钙蛋白-T(Troponin-T)及钙激活酶活性的变化。结果表明,在成熟过程中肌原纤维发生了降解,其中肌间线蛋白、肌钙蛋白-T发生了显著的降解,同时钙激活酶中μ-钙激活酶的活性也逐渐降低。从而证实μ-钙激活酶活性与肌原纤维蛋白降解存在负相关的关系。由此可知钙激活酶在羊肉成熟过程,参与了肌原纤维的降解,促进了羊肉的成熟嫩化。     

氯化钙注射对鹅肉成熟机制及品质影响的研究

为了探究氯化钙溶液注射对鹅肉骨骼肌组织嫩化机制和保水性的影响,本文以浙东白鹅为研究对象,分析了鹅肉宰后储存过程中,钙蛋白酶和凋亡酶3的活性,肌原纤维蛋白的降解程度和二级结构含量的变化,以及测定了鹅肉的剪切力值和蒸煮损失率。研究结果表明,与对照组相比,150 m M氯化钙处理后显著提高了calpain和caspase3活力,加速了肌原纤维蛋白的降解,有效降低鹅肉的剪切力值,但蒸煮损失率略大于对照组。拉曼光谱分析肌原纤维蛋白二级结构含量显示,150 m M氯化钙处理导致肌原纤维蛋白α-螺旋逐渐转变为无规则卷曲(p0.01),而注水处理和对照组肌原纤维蛋白α-螺旋则转变为β-折叠。氯化钙的注射浓度由150 m M增加至300 m M时,calpain和caspase3的活性未明显增强,鹅肉的剪切力值并也未显著下降(p0.05),不能有效改善鹅肉的嫩度。     

碱性蛋白酶降解鲢鱼肌原纤维蛋白的组学分析

探究腐败菌引起水产品腐败变质的机理,揭示地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶降解白鲢鱼肌原纤维蛋白的途径及机制。采用双向凝胶电泳体系分别研究4℃和25℃条件下碱性蛋白酶对白鲢鱼肌原纤维蛋白的降解情况。结果表明:随着酶处理时间的增加,蛋白图谱中蛋白点的数量呈先增加后减少的趋势。通过PDQuest软件找出75个差异蛋白点,其中4℃组有45个,25℃组有30个。对割胶成功的24个蛋白点进行质谱鉴定,结果显示为肌动蛋白、肌球蛋白重链等。利用GO功能注释,对这24个蛋白质进行生物信息学分析,从细胞组成、分子功能和生物过程层面上推测碱性蛋白酶降解肌原纤维蛋白的途径为:首先破坏肌原纤维骨架结构,肌动球蛋白解体为肌动蛋白和肌球蛋白,随后肌球蛋白及肌动蛋白进一步被分解为其它产物,如肌球蛋白重链等。     

L-赖氨酸对鸡腿肉肌原纤维蛋白磷酸化的影响

为研究高盐(3%NaCl)和低盐(1%NaCl)条件下添加L-赖氨酸(L-Lys)对鸡腿肉肌原纤维蛋白磷酸化的影响,提取腌制后的鸡腿肉肌原纤维蛋白,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,再通过荧光染色和液相色谱-串联质谱鉴定,探究添加L-Lys在不同NaCl用量条件下对鸡腿肉肌原纤维蛋白磷酸化水平的差异。结果表明,1%Na Cl+0.06%L-Lys组整体磷酸化水平显著低于0%Na Cl组和1%Na Cl组(P0.05),但与3%Na Cl组和3%Na Cl+0.06%L-Lys组整体磷酸化水平无显著差异(P0.05),表明添加L-Lys能够在低盐条件下降低鸡腿肉肌原纤维蛋白磷酸化水平。1%NaCl+0.06%L-Lys组α-辅肌动蛋白-2、β-烯醇化酶、原肌球蛋白α-1链、肌球蛋白轻链2、肌球蛋白轻链3较1%NaCl组的磷酸化水平显著降低(P0.05),1%NaCl+0.06%L-Lys组的肌球蛋白重链、M蛋白、β-烯醇化酶、肌球蛋白轻链2、肌球蛋白轻链3的磷酸化水平显著低于3%NaCl组(P0.05)。结果表明,0.06%L-Lys的添加在1%NaCl条件下对肌原纤维蛋白磷酸化具有整体正向效应。     

Effects of Papain and a Microbial Enzyme on Meat Proteins and Beef Tenderness

ABSTRACT: The relative effects of an aspartic proteinase (AP) and papain on meat proteins and beef tenderness were evaluated by measuring release of hydroxyproline in collagen, and breakdown of myofibrillar proteins. Tenderness was objectively measured by Warner-Bratzler shear. AP showed self-limiting hydrolysis of myofibrillar proteins resulting in 25 to 30% improvement in meat tenderness and was not adversely affected by pH, salt, phosphate, and ascorbate concentrations often encountered in meat processing. Like papain, its tenderizing effect was expressed primarily during cooking and caused no ignificant changes (p > 0.05) in tenderness during frozen or refrigerated storage. It was also inactivated at cooking temperatures in excess of 60 °C, therefore eliminating any undesirable side effects that may be associated with residual protease activity.     

Phosphoproteomic profiling of myofibrillar and sarcoplasmic proteins of muscle in response to salting

A phosphoproteomic profile of myofibrillar and sarcoplasmic proteins of muscle in response to salting was investigated. Myofibrillar and sarcoplasmic proteins extracted from salted meat with 0, 1, 2, 3, 4, and 5% salt for 0, 2, 4, 6, 8, and 16 h were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and fluorescence staining. The global phosphorylation of myofibrillar proteins in salted meat was lower than that in control muscle at 16 h of salting (p<0.05), and the global phosphorylation of myofibrillar proteins in 3% salt-treated group at 16 h was the lowest. However, salting showed no significant effect on phosphorylation of sarcoplasmic proteins. Four categories of phosphorylated protein were identified by LC-MS/MS, involved in stress response (heat shock protein), glycometabolism (glycogen phosphorylase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), oxidation or reduction (superoxide dismutase), and others (myoglobin), the phosphorylation of which was affected by salting. Thus, salting may influence meat quality through protein phosphorylation, which regulates protein degradation and glycolysis.     

The protection of bovine skeletal myofibrils from proteolytic damage post mortem by small heat shock proteins

This study aimed to determine how small heat shock proteins (sHSPs) protect myofibrillar proteins from μ-calpain degradation during ageing. Immunoprecipitation experiments with M. longissimus dorsi (LD) from Angus heifers (n = 14) examined the interaction between αβ-crystallin, desmin, titin, HSP20, HSP27 and μ-calpain. Results showed that αβ-crystallin associated with desmin, titin, HSP20, HSP27 and μ-calpain. Exogenous αβ-crystallin reduced desmin and titin degradations in myofibrillar extracts and attenuated μ-calpain activity. In a second experiment, bull LD (n = 94) were aged at − 1.5 °C for up to 28 days post mortem. μ-Calpain autolysed faster in high ultimate pH (pH_u) meat (pH_u ≥ 6.2) and this was concomitant with the more rapid degradation of titin and filamin in this pH_u group. Desmin stability in intermediate pH_u meat (pH_u 5.8 to 6.19) may be due to the protection of myofibril-bound sHSPs combined with the competitive inhibition of μ-calpain by sHSPs.     

Identification of myofibrillar substrates for μ-calpain

To identify myofibrillar substrates of μ-calpain under post-mortem conditions, a combination of SDS–PAGE, two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) was used. Purified myofibrils were incubated with μ-calpain under post-mortem-simulated conditions for two or four days at 4 °C. The resulting protein changes were analyzed by SDS–PAGE and 2DE. The μ-calpain-mediated protein changes were identified by peptide-mass mapping using MALDI-TOF MS and revealed that desmin, actin, myosin heavy chain, myosin light chain I, troponin T, tropomyosin 1, tropomyosin 4, thioredoxin and CapZ are all degraded in vitro by μ-calpain. The findings that actin and myosin heavy chain are substrates of μ-calpain were rather surprising, as it has previously been reported that these proteins are resistant to μ-calpain degradation. However, both actin and myosin heavy chain are poor substrates compared with desmin.     

羟自由基氧化对高白鲑肌原纤维蛋白降解的影响

为了探究羟自由基氧化对鱼肉宰后贮藏期间肌肉蛋白降解的影响,以高白鲑为研究对象,取其背部肌肉进行氧化,研究羟自由基氧化对高白鲑肌原纤维蛋白降解的影响。设置4 组不同浓度的氧化体系（1 mmol/L H2O2＋0.2 mmol/L FeCl3、5 mmol/L H2O2＋0.4 mmol/L FeCl3、10 mmol/L H2O2＋0.8 mmol/L FeCl3、20 mmol/L H2O2＋1.0 mmol/L FeCl3）,并分别室温氧化0、15、30、60、90 min,以羰基含量确定最适氧化浓度和时间;氧化样品于4 ℃贮藏,分别在0、1、7、14 d取样,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹检测肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）、肌动蛋白、肌间线蛋白和肌钙蛋白T等蛋白的降解程度。结果表明：5 mmol/L H2O2＋0.4 mmol/L FeCl3的氧化浓度下孵育60 min为本实验最适氧化条件;氧化组MHC的降解率比未氧化组高,羟自由基氧化显著促进了MHC的降解（P＜0.05）;肌动蛋白变化不显著（P＞0.05）,自然降解占主导地位;氧化组中肌间线蛋白和肌钙蛋白T的降解率低于未氧化组,羟自由基氧化抑制了肌间线蛋白和肌钙蛋白T的降解。综上所述,羟自由基氧化主要促进肌纤维中粗丝蛋白的降解,对细丝蛋白的降解没有明显影响,对细胞骨架蛋白和连接蛋白的降解起到抑制作用。     

宰后早期猪肉、牛肉和鸡肉中能量代谢及蛋白质磷酸化

目的:探讨畜禽肉宰后能量代谢的差异及其可能的原因。方法:于宰后45 min测定鸡肉、灰白(pale soft exudative,PSE)猪肉、正常猪肉和牛肉中糖原、ATP/ADP/AMP含量及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,并提取肌浆和肌原纤维蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和液相色谱-串联质谱鉴定,分析各组肉的磷酸化水平差异。结果:牛肉中糖原含量显著高于其他组(P0.05),正常猪肉组糖原和ATP含量显著高于PSE猪肉组和鸡肉组(P0.05),而PSE猪肉组的LDH活性显著高于其他组(P0.05);肌浆蛋白SDS-PAGE ProQ染色表明,宰后45 min PSE猪肉组中6个条带的磷酸化水平显著低于正常猪肉组(P0.05),而另有6个条带的磷酸化水平显著高于正常猪肉组(P0.05)。牛肉组和鸡肉组中分别有3个和1个条带的磷酸化水平偏低,1个条带和8个条带的磷酸化水平明显偏高。而肌原纤维蛋白电泳表明,牛肉中大部分蛋白质的磷酸化水平处于最高值,而鸡肉组处于最低值,猪肉介于两者之间;PSE猪肉组中7个条带的磷酸化水平显著低于正常猪肉(P0.05);6个条带的磷酸化水平显著高于正常猪肉(P0.05)。结论:宰后异质肉的形成受宰后糖原和ATP消耗速率、LDH活性的影响,同时与肌肉中糖酵解酶的磷酸化水平有关。     

预处理对南美白对虾剥壳效果和肌原纤维蛋白的影响

采用不同方法(酶、冷冻和冰盐)对南美白对虾进行预处理,比较处理后虾壳可剥性及剥壳后虾仁质构,分析肌原纤维蛋白的理化指标和结构变化,探究预处理辅助剥壳效果及其对南美白对虾肌原纤维蛋白的影响。结果表明,与冷冻和冰盐处理相比,3.5 h酶处理辅助剥壳的剥壳用功较少,且完全剥壳率与其他两种方法无显著差异(P>0.05);Ca²⁺-ATPase活力、总巯基与活性巯基含量、内源荧光强度明显低于鲜虾,但除Ca²⁺-ATPase活力外,降低程度明显不及冷冻和冰盐处理组;其表面疏水性与鲜虾无显著差异(P>0.05),羰基含量与冰盐处理组无显著差异(P>0.05)。傅里叶变换红外光谱结果显示,预处理后肌原纤维蛋白的α-螺旋、β-转角相对含量都无显著变化(P>0.05),但酶和冰盐处理组均出现了β-折叠向无规卷曲的转变。结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果可知,冷冻和冰盐处理只改变了蛋白的结构而没有引...