刺玫果多酚对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

通过ox-LDL诱导的兔胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC),建立体外细胞模型,研究刺玫果多酚对VSMC增殖及VSMC分泌NO能力的影响。研究结果表明:刺玫果多酚具有抑制VSMC的异常增殖和提高NO生成量的功效,其作用机制可能与预防动脉粥样硬化的功能有关。     

自制研发奶粉对ox-LDL诱导平滑肌细胞增殖的影响

研究自制研发的中老年心血管奶粉对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的平滑肌细胞增殖与NO释放量的影响。用ox-LDL诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖,建立VSMC增殖模型,通过比较自制奶粉与3种常见市售奶粉对模型细胞的增殖抑制作用和NO释放量的数据结果,评价实验室自制研发奶粉的功效。结果表明,30μg/mL的ox-LDL作用VSMC 24 h可极显著的促进细胞增殖并抑制NO的释放(p0.01),说明模型构建成功;在此VSMC增殖模型中分别添加奶粉样品,得出自制奶粉在200、400、800μg/mL均能抑制ox-LDL诱导的VSMC的增殖,且在400μg/mL的抑制作用极显著(p0.01),并均能极显著的促进NO的释放(p0.01)。说明自制研发的中老年心血管奶粉能够抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖模型,具有较好的预防动脉粥样硬化的功效。     

燕麦乙醇提取物分级萃取组分对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

选用不同极性的溶剂对燕麦乙醇提取物进行分级萃取,并对得到的4 种不同萃取组分进行体外DPPH 自由基清除能力、抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖能力及促进VSMC 释放NO 能力进行评价。结果发现：4 种组分中,乙酸乙酯萃取组分具有最强的DPPH 自由基清除能力,其EC50 值为(2.5 ± 0.4)mg/mL;通过抑制VSMC 增殖的实验研究发现,乙酸乙酯萃取组分能显著抑制VSMC 增殖,提高VSMC 产NO 能力。选用HPLC 对乙酸乙酯萃取组分进行初步分析发现其主要含有3 种蒽酰胺组分,分别为Bc、Bp 和Bf。     

枸杞多糖抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞活化作用机制

目的：探究宁夏枸杞多糖对转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）诱导的心脏纤维化细胞模型干预作用。方法：分离培养小鼠原代心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs），用质量浓度10 ng/mL TGF-β1作用于CFs，建立心脏纤维化细胞模型，采用宁夏枸杞多糖进行处理，观察细胞形态；免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达水平；Western blot检测TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达及其磷酸化水平；实时荧光定量聚合酶链式反应检测Snail、Twist和S100A4 mRNA的表达水平。结果：与对照组相比，模型组加入TGF-β1后，CFs细胞的形态由梭形变得狭长，细胞数目显著增多；α-SMA蛋白相对表达量升高；TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达及其磷酸化水平升高；Snail、Twist和S100A4的mRNA表达水平高度显著升高（P＜0.001）；给予宁夏枸杞多糖处理，可高度显著抑制TGF-β1诱导的CFs增殖（P＜0.001），减少CFs细胞中α-SMA及TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达，高度显著下调Snail、Twist和S100A4的mRNA表达（P＜0.001）。结论：枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs纤维化具有改善作用，其作用机制与抑制TGF-β1/Smads信号通路有关。     

乳源酪蛋白糖巨肽对NF-κB信号通路中关键蛋白的调控作用

以结肠癌细胞HT-29为细胞系,在确定乳源性酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的HT-29细胞核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)亚单位p65蛋白影响的基础上,在最适作用时间条件下,利用Western blotting技术进一步检测乳源CGMP对NF-κB信号通路上关键蛋白IκBα、p-IκBα、E3RSIκB、UBC5表达水平的影响,以阐述乳源CGMP调控NF-κB信号通路中关键蛋白的作用机制。结果表明:乳源CGMP组的3种质量浓度(0.001、0.010、0.100?μg/m L)均可在一定程度上抑制LPS诱导的HT-29细胞NF-κB信号通路上IκBα蛋白的降解,0.100?μg/m L作用较为明显,与空白对照组比较有显著性差异(P0.01)。研究明确地证实了乳源CGMP可通过抑制p-IκBα、E3RSIκB、UBC5蛋白的表达来抑制IκBα蛋白的降解,进而抑制NF-κB信号通路的激活。结论:乳源CGMP可显著降低NF-κB信号通路关键蛋白IκBα的降解,其机制是抑制了IκBα的磷酸化和泛素化,使p-IκBα和泛素化关键蛋白E3RSIκB和UBC5的表达均有所下降,进而减少了IκBα的降解,增加了IκBα-p65-p50蛋白三聚体的数量,使p65蛋白核移位效应降低,进而减少下游基因的表达。因此,研究结果科学地阐释了乳源CGMP是通过调控NF-κB信号通路发挥抗炎的作用。     

枸杞中绿原酸对转化生长因子-β1诱导心肌成纤维细胞纤维化的影响

目的：考察枸杞中分离得到的绿原酸对转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）纤维化的干预效果。方法：质量浓度10 ng/mL TGF-β1诱导CFs建立心肌纤维化细胞模型，用不同质量浓度绿原酸处理纤维化细胞，细胞毒性实验（cell counting kit-8，CCK-8）检测绿原酸对CFs增殖的影响；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测纤维化标志蛋白胶原蛋白（collagen，Col）I、Col III和免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达；实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测Twist1、Acta2、Snail2及纤维化蛋白S100A4等mRNA表达水平；Western blot检测TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白及其磷酸化表达水平。结果：CCK-8检测表明枸杞中分离得到的绿原酸能抑制细胞异常增殖；ELISA和免疫荧光检测表明，枸杞中分离得到的绿原酸能下调纤维化标志蛋白Col I、Col III和α-SMA的表达；qPCR检测表明枸杞中分离得到的绿原酸能高度显著下调纤维化转录调控因子Acta2、Twist1、Snail1、Snail2、Smad4及纤维化蛋白S100A4的mRNA表达（P＜0.001）；Western blot检测表明枸杞中分离得到的绿原酸能高度显著下调TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达（P＜0.001）。结论：在本研究质量浓度范围内，枸杞中分离得到的绿原酸抑制TGF-β1诱导的CFs纤维化过程，其机制可能与TGF-βl/Smads信号通路有关。     

海带多糖硫酸酯对bFGF诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:研究海带多糖硫酸酯WPS、WPS-1、WPS-2和WPS-3对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法:采用组织贴块法培养VSMC并用免疫组织化学染色法对VSMC进行鉴定;采用bFGF诱导VSMC增殖;以MTT法检测海带多糖硫酸酯对bFGF诱导的VSMC增殖的影响;黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产超氧阴离子自由基(O2-.)体系测定海带多糖硫酸酯对O2-.的清除力。结果:在0.1～1mg/mL质量浓度范围内,WPS、WPS-1和WPS-3对bFGF诱导的VSMC增殖具有抑制作用,其中WPS的增殖抑制性表现显著。WPS-2则对VSMC增殖基本无影响。在O2-.清除力上,WPS-2对O2-.清除率仅为34%,而其他组分自由基清除率均超过70%。结论:WPS、WPS-1和WPS-3对bFGF诱导的VSMC增殖均有显著抑制作用,且抑制作用可能与它们的自由基清除能力相关。     

异甘草素对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用

目的：考察异甘草素对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,探究其作用机制。方法：采用3T3-L1前脂肪细胞,利用磺酰罗丹明B（sulforhodamine B,SRB）法检测异甘草素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,采用传统的鸡尾酒法诱导3T3-L1细胞分化为脂肪细胞,利用油红O染色法检测分化细胞脂滴形成;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应方法,检测细胞CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT-enhancer-binding proteins,C/EBP）亚型C/EBPα、C/EBPβ、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）、脂肪分化相关蛋白adipophilin、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated receptor γ,PPARγ）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK）的mRNA表达水平,Western blotting法检测AMPK蛋白磷酸化水平。结果：异甘草素可浓度依赖性地抑制3T3-L1细胞增殖,并明显抑制分化细胞内脂滴形成,同时抑制了细胞分化相关基因C/EBPα、C/EBPβ、FAS、adipophilin、PPARγ mRNA的表达,AMPK mRNA的表达未受影响,但异甘草素处理明显上调了AMPK蛋白的磷酸化水平。结论：异甘草素可抑制3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,其机制可能与活化AMPK信号通路相关。     

壬基酚异构体NP42对小鼠RAW264.7巨噬细胞的损伤作用

目的:研究壬基酚异构体NP42对小鼠巨噬细胞RAW264.7的损伤作用并探究其分子机制。方法:以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,将不同浓度NP42(0.1~100 μmol/L)作用于细胞24 h,采用噻唑蓝法检测细胞存活率,酶联免疫分析检测环磷酸鸟苷(cGMP)和环磷酸腺苷(cAMP)含量,RT-PCR法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表达水平,Western blot法检测蛋白激酶C(PKC)的表达情况以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化水平。结果:0.1~10 μmol/L NP42对细胞存活率无显著影响,100 μmol/L NP42能显著降低RAW264.7细胞的存活率(P < 0.01)。与对照组相比,NP42处理24 h能显著抑制细胞TNF-α mRNA和iNOS mRNA的表达,抑制细胞PKC蛋白的表达和降低细胞内cAMP的含量,同时增强细胞内cGMP的含量。NP42处理能显著下调p38的磷酸化水平。结论:壬基酚异构体NP42通过PKC-cAMP信号通路以及p38-MAPK信号通路对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生损伤作用,这可能是壬基酚发挥免疫损伤的主要分子机制。     

草苁蓉提取物对小鼠H22肝癌移植瘤血管生成的抑制作用

探讨富含环烯醚萜苷的草苁蓉提取物(IGBR)对H_(22)小鼠移植瘤血管生成的抑制作用。建立H_(22)肝癌皮下移植瘤模型,并用IGBR干预10 d。利用HE染色法观察肿瘤组织病理学改变,利用免疫组化法检测肿瘤组织内微血管密度(MVD),利用蛋白印迹法检测肿瘤组织缺氧诱导因子(HIF)-1α、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)-2蛋白的表达。与模型组比较,IGBR组肿瘤细胞生长受抑,细胞数目较少,坏死程度较严重。与模型组比较,IGBR组肿瘤组织MVD显著降低;HIF-1α、VEGF和VEGFR-2蛋白的表达显著降低。提示IGBR对H_(22)小鼠移植瘤新生血管生成具有抑制作用,可能与下调肿瘤组织HIF-1α和VEGF的蛋白表达有关。     

Sulforaphane inhibits smooth muscle cell proliferation and migration by reducing MMP-9 activity via the Ras and RhoA/ROCK pathways

Vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation and migration triggered by inflammatory stimuli are involved in the development and progression of atherosclerosis. Here, we investigate the capacity of sulforaphane (SFN) on TNF-α-induced proliferation, migration and signal transduction in A7r5 smooth muscle cells. SFN inhibited the migration ability of A7r5 cells induced by TNF-α using wound healing assay and Boyden chamber assay. After treatment of SFN at various concentrations with TNF-α, A7r5 cell reduced matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expression. Fluorescent phalloidin staining demonstrated that increased intense F-actin staining in the TNF-α-induced A7r5 cells was inhibited by SFN. The levels of Ras and RhoA/ROCK-related proteins in the TNF-α treated A7r5 cells were increased, whereas these protein expression were attenuated by SFN. The results suggested that SFN could mediate A7r5 cells migration by reducing MMP-9 activity involving the suppression of the Ras and RhoA signaling pathways.     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR 方法从马铃薯(Solanum tuberosum)茎段总RNA 中扩增、克隆amyA1 基因(NCBI 登录号GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR 方法检测amyA1 基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析amyA1 密码子的偏好性;同时对AmyA1 氨基酸的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行预测。基于NCBI 数据库中有物种代表性的29 种α - 淀粉酶基因序列构建了基因进化树。amyA1 基因全长1224bp,可编码一条理论分子质量为46.40kD、407 个氨基酸残基组成的、可能为亲水性的胞外酶。与NCBI已登记的马铃薯α - 淀粉酶基因(登录号M79328.1)核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20～348 位点范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13 家族及亚家族相似的催化活性域(PF00128、SM00624),第349～407位点范围内的氨基酸残基含有α - 淀粉酶C- 末端β折叠区域(PF07821)。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的(β /α) 8 桶状结构以及其他几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,两个马铃薯α - 淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦、玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05 α-淀粉酶基因的克隆和原核表达

本实验室从新疆盐湖分离得到一株产α-淀粉酶中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05,根据已报道的α-淀粉酶基因(α-AMY)序列的保守区域设计引物,从中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05基因组中扩增出α-淀粉酶基因片段,将α-淀粉酶基因纯化后克隆到pGM-T载体上测序,结果表明α-淀粉酶基因片段长约1500bp,与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的α-淀粉酶基因序列的同源性为95%,两种序列具有一定的同源性。按正确的阅读框架将α-淀粉酶基因片段定向克隆到表达载体pET-32a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,α-淀粉酶基因能在大肠杆菌BL21中成功表达,确定表达蛋白的相对分子量为61kD左右,与理论推导的分子量相一致;构建的大肠杆菌工程菌,所产生的α-淀粉酶是包涵体,通过超声波粉碎仪粉碎后,测α-淀粉酶酶活为原菌的1.8倍。     

Effect of N-(p-coumaroyl)serotonin and N-feruloylserotonin, major anti-atherogenic polyphenols in safflower seed, on vasodilation, proliferation and migration of vascular smooth muscle cells

Scope: The objective of this study is to investigate a vascular effect of N‐(p‐coumaroyl)serotonin (CS) and N‐feruloylserotonin (FS), major antioxidative indolic polyphenols in safflower seeds with anti‐atherogenic properties, with emphasis on effects on vascular smooth muscle cells (VSMCs). Methods and results: Both CS and FS (each 10 to 100 μM) relaxed rat femoral arteries, which were pre‐contracted by 10^?5 M phenylephrine or 50 mM KCl, independently of their endothelium. Both CS and FS also concentration‐dependently inhibited the increase of cytosolic free Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺]_i) that was induced by KCl or 5‐hydroxytryptamine in cultured rat VSMCs. Next, we examined the effects of CS and FS on platelet‐derived growth factor (PDGF)‐BB‐evoked proliferation and migration of the VSMCs. Both CS and FS inhibited PDGF‐BB‐evoked proliferation and migration of the VSMCs in a concentration‐dependent manner. They also inhibited PDGF‐BB‐induced phosphorylation of PDGF receptor β and ERK1/2, and Ca²⁺ release from sarcoplasmic reticulum in the VSMCs in a concentration‐dependent fashion. Conclusion: These results indicated a possible vascular effect of CS/FS to inhibit the activation of VSMCs by blocking the increase of [Ca²⁺]_i and/or blocking PDGF signaling. These may explain a part of anti‐atherogenic mechanism that underlies their ability to improve vascular distensibility and to inhibit aortic hyperplasia.     

应用前沿亲和色谱评价5 种知母糖苷类化合物的α-淀粉酶抑制活性

以硅胶为载体,制备α-淀粉酶亲和色谱柱,以线扫循环伏安法为检测方法,评价知母提取物的α-淀粉酶抑制活性。首先考察固定化条件对固定化酶的影响以及亲和色谱柱的稳定性。其次利用前沿亲和色谱检测5 种知母糖苷类化合物（新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ）的α-淀粉酶亲和力。最后检测化合物的α-淀粉酶抑制活性。结果表明5 种化合物的α-淀粉酶结合力大小排序为：新芒果苷（Kd＝0.230 5 μmol/L）＞芒果苷（Kd＝0.299 5 μmol/L）＞知母皂苷BⅡ（Kd＝0.312 4 μmol/L）＞知母皂苷BⅢ （Kd＝0.316 2 μmol/L）＞知母皂苷AⅡ（Kd＝0.453 3 μmol/L）,其排序结果与样品的α-淀粉酶抑制活性一致。说明前沿亲和色谱可以用来定量检测化合物的α-淀粉酶抑制活性,且可根据亲和力的大小将化合物的抑制活性进行排序。     

具有α-淀粉酶抑制活性的白芸豆多肽的制备及其热稳定性研究

以白芸豆为原料,酶法制备多肽。以α-淀粉酶抑制率为指标,比较酸性、中性和碱性蛋白酶的酶解效果。结果表明:3.350酸性蛋白酶的酶解效果最好。通过加酶量、酶解p H值、酶解温度和酶解时间的单因素试验和正交试验,得到制备白芸豆多肽的最佳工艺条件为:加酶量3 200 U/g、酶解p H 2.2、酶解温度55℃、酶解时间60 min,此条件下白芸豆多肽α-淀粉酶抑制率为80.82%。热稳定性研究表明,白芸豆多肽的热稳定性高于α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor,α-AI)粗提液,该多肽在85、90℃条件下的α-淀粉酶抑制活性能保持更长时间。凝胶电泳分析表明白芸豆多肽的分子质量为7.53~9.09 ku。     

多穗柯三叶苷的抑制糖尿病关键酶活性和抗氧化性

从多穗柯中提取分离得到三叶苷,以抗糖尿病药物阿卡波糖为阳性对照,检测多穗柯三叶苷对小肠α-葡萄糖苷酶和胰脏α-淀粉酶活性的抑制作用和对α-葡萄糖苷酶活性抑制类型,并以芦丁为阳性对照检测其清除DPPH自由基能力。结果显示：多穗柯三叶苷对α-葡萄糖苷酶有明显抑制作用,为非竞争性抑制,抑制效果与阿卡波糖无明显差别,对α-淀粉酶活性的抑制率低于阿卡波糖;清除DPPH自由基能力强于芦丁。表明多穗柯三叶苷是一种有应用潜力的抗糖尿病活性物质。     

增强型绿色荧光蛋白在DH5α大肠杆菌中的表达

采用PCR 技术从pEGFPpA-CAN 克隆载体中扩增出增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP),插入到pGEM-T easy载体中,构建pGT-EGFP 重组质粒,其中的SP6 启动子可用来表达EGFP 蛋白。携带pGT-EGFP 重组载体的DH5α大肠杆菌较普通DH5α大肠杆菌菌液略带淡绿色,在荧光显微镜下能够清晰观察该大肠杆菌的形态,带有绿色荧光。同时超声裂解携带pGT-EGFP 重组载体的DH5α大肠杆菌,提取菌体总蛋白,SDS-PAGE 显示EGFP 蛋白是以可溶性蛋白形式存在的,分子质量大约为30kD,与其理论值大小一致。