高白鲑肌肉蛋白质组双向电泳技术体系的优化

为建立高白鲑肌肉蛋白质双向电泳分析方法,通过固相p H梯度胶条等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离,分别考察了蛋白质样品制备方法、上样量、IPG胶条p H值、等电聚焦程序、助凝剂剂量、SDS-PAGE凝胶浓度及染色方法等影响的因素。结果显示,采用丙酮沉淀法制备蛋白质样品,上样量90μg,IPG胶条pH值5～8,一向胶聚焦时间400 V 16 h+1 000 V 2 h,平衡时间15 min,0.05 m L过硫酸铵及2μL TEMED,10%(体积分数)二向分离胶和硝酸银染色时,获得蛋白质分离效果好,分辨率高及横纹少的高白鲑肌肉蛋白质二维电泳图谱,为高白鲑肌肉蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。     

白鲢鱼肌原纤维蛋白双向电泳分析体系的建立

以白鲢鱼为研究对象,建立并优化其肌原纤维蛋白的双向电泳技术。结果表明,选用固相p H值梯度预制胶条p H 4~7,上样量120μg,等电聚焦程序Ⅲ(50 V主动水化15 h,250 V、2 h,1 000 V、2.5 h及4 000 V、3 h三段式除盐,8 000 V、2 h和10 000 V、1.5 h两段式升压,10 000 V聚焦80 000 V·h,500 V保持10 h)以及12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶条件下进行双向电泳,凝胶银染后用PDQuest软件分析,得到具有高分离度的肌原纤维蛋白双向电泳图谱,蛋白点清晰。     

阪崎克罗诺杆菌全菌蛋白质双向电泳技术和图谱的建立

建立阪崎克罗诺杆菌全菌蛋白双向电泳技术。采用2种不同的尿素-3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)-二硫苏糖醇(DTT)裂解法兼反复冻融提取阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544全菌蛋白,在2种pH范围的固相pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳,胶体考染后获得的双向电泳图谱进行Image Master 2DPlatinum软件分析。结果表明,获得全菌的蛋白浓度为5.32μg/μL;裂解液成分:尿素7 mol/L,硫脲2 mol/L,CHAPS 4%(m/V),DTT 1%(m/V),PMSF 45mg/L,pH 3～10IPG缓冲液2%(V/V)。该技术成功构建了阪崎克罗诺杆菌全菌蛋白质双向电泳图谱。     

油茶种仁总蛋白提取及双向电泳分析

以油茶种仁为实验材料,用不同方法提取油茶种仁总蛋白,同时对双向电泳条件进行了探索与优化,建立了一套适合油茶种仁总蛋白双向电泳分析的优化体系。结果表明:改良后的TCA-丙酮法可以有效提取出油茶种仁总蛋白,得到了816个蛋白点,蛋白点主要集中在等电点p H 4.0~6.0之间;选用17 cm p H 4~7 IPG胶条,优化的等电聚焦程序为250 V 0.5 h、1 000 V 2 h、8 000 V5 h、8 000 V 60 000 Vh和500 V 24 h,可获得背景清晰、分辨率较高的双向电泳图谱。     

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan—GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料,采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白,对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明,采用理想的蛋白质裂解液（7mol／L尿素,2mol／L硫脲,4％CHAPS（3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐）,65mmol二硫苏糖醇,0．5％IPG缓冲液pH3～10或pH4～7,全蛋白酶抑制片剂（片／10mL））裂解蛋白,以150μg上样,按IEF程序Ⅱ（30V,12h;200V,1h;500V,1h;1000V,0．5h;10000V,2h;10000V,8h）进行等电聚焦,10％SDS—PAGE胶浓度进行第二向电泳,银染方法检测,可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。     

凡纳滨对虾肌肉蛋白质双向电泳分离技术的建立及优化

建立凡纳滨对虾肌肉组织双向电泳分离技术并对其进行优化。通过液氮研磨和液氮研磨+超声破碎的方式提取对虾肌肉组织蛋白质。采用7 cm的IPG胶条进行双向电泳,凝胶染色后进行图谱分析,并对裂解液配方、胶条p H值、蛋白质上样量、凝胶染色进行优化。结果显示,以液氮研磨+超声破碎,裂解液Ⅱ提取对虾肌肉蛋白质;采用p H 4~7 IPG胶条,180μg蛋白质上样量,并用考马斯亮蓝G-250胶体考染(蓝银)染色,成功得到背景清晰,分辨率较高的凡纳滨对虾肌肉蛋白质双向电泳图谱,这为凡纳滨对虾肌肉蛋白质组学分析及肌肉品质变化的分子标记识别提供基础。     

羟基自由基氧化对大豆分离蛋白结构特性的影响

探讨氧化对大豆分离蛋白结构特性的影响。采用羟基自由基氧化体系,在不同的H2O2浓度(0.1,0.5,1,5,10,15 mmol/L)下对大豆分离蛋白氧化1 h。测定氧化前、后大豆分离蛋白的总巯基和活性巯基,紫外扫描、色氨酸荧光分析以及蛋白聚合物变化趋势。研究结果表明,在氧化条件下,大豆分离蛋白的总巯基和活性巯基含量显著降低(P0.05);紫外扫描图谱的峰强度明显减弱,出峰位置发生蓝移;色氨酸荧光峰位先红移后蓝移。聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,氧化使大豆分离蛋白产生非二硫键的共价交联。氧化能在一定程度上改变大豆分离蛋白的结构特性。     

脂质氢过氧化物氧化对核桃分离蛋白结构的影响

采用脂肪氧合酶催化亚油酸构建脂质氢过氧化物——核桃分离蛋白氧化体系,研究脂质氧化反应中产生的氢过氧化物对核桃分离蛋白结构特性的影响。结果显示,向100 m L 0. 05 mg/m L蛋白溶液中添加9 m L亚油酸,核桃分离蛋白溶解度下降至6. 89%,游离巯基含量由2. 82μmol SH/g下降至1. 92μmol SH/g,羰基含量由2. 26 nmol/mg增加至4. 23 nmol/mg,表明氧化后核桃蛋白理化特性产生变化。圆二色谱分析表明,蛋白质氧化导致核桃分离蛋白α-螺旋和β-折叠含量下降,β-转角和无规则卷曲含量上升。随着亚油酸添加量的增加,蛋白质氧化程度加大,核桃分离蛋白表面疏水性从429. 66下降到405. 24。内源荧光最大荧光峰位红移,内源荧光强度下降,此结果表明,脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)催化亚油酸氧化诱导核桃分离蛋白聚集,并进一步使蛋白质二级和三级结构发生变化。体积凝胶色谱法结果显示,核桃分离蛋白氧化后,小分子多肽含量下降,高分子量聚集体含量增加,说明脂质氢过氧化物氧化修饰导致核桃蛋白结构改变,形成氧化聚集体。     

不同细胞破碎方法对肉牛、牦牛背最长肌双向电泳图谱的影响

采用液氮研磨、液氮研磨辅助超声波破碎和液氮研磨辅助玻璃珠破碎3种细胞破碎方法对肉牛、牦牛背最长肌蛋白质提取和双向电泳图谱效果的最佳方法进行研究。在相同裂解液组成、等电聚焦程序、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)操作、银染法染色等双向电泳条件的处理下,通过Bradford法分别测定不同方法提取的肉牛和牦牛肉背最长肌中蛋白质的含量,并采用PDQuest 8.0.1软件对双向电泳图谱的效果进行分析。结果表明:3种细胞破碎方法提取的肉牛和牦牛背最长肌蛋白质含量差异显著,其中液氮研磨辅助超声波破碎法((2.59±0.15)、(2.84±0.29)μg/μL)显著高于其他2种方法,液氮研磨辅助玻璃珠破碎法((2.01±0.04)、(2.21±0.02)μg/μL)显著高于液氮研磨法((1.77±0.11)、(1.95±0.19)μg/μL)。3种方法所得肉牛背最长肌双向电泳图谱的蛋白点个数分别为(279±19)、(581±15)、(363±21)个;所得牦牛肉双向电泳图谱的蛋白点个数分别为(292±15)、(596±12)、(385±17)个。3种方法中液氮研磨辅助超声波破碎法提取的肉牛、牦牛背最长肌蛋白质含量最高,数量最多,蛋白点分离程度最好,并且3种细胞破碎方法在牦牛背最长肌中提取的蛋白质含量与肉牛背最长肌中提取的蛋白质含量差异不显著。     

地衣芽孢杆菌总蛋白双向电泳方法的建立和优化

探索建立有效的地衣芽孢杆菌蛋白质组双向电泳体系,为进一步揭示地衣芽孢杆菌促进氧化葡萄糖酸杆菌产酸的作用机制奠定基础.以地衣芽孢杆菌为材料,比较蛋白质制备超声破壁时间、新型细胞裂解液、pH梯度和不同上样量对地衣芽孢杆菌蛋白双向电泳结果的影响.结果显示:采用15min超声破壁提取地衣芽孢杆菌总蛋白,选用新型蛋白质裂解,用长24cm、pH4～7的IPG胶条,在上样量为80μg进行等电聚焦,于60V 15min、120V 6h条件下进行SDS-PAGE垂直电泳,可以获得背景清晰、重复性好的双向电泳图谱.在探索出一种新型可行的新型细胞裂解液的同时,建立一套用于地衣芽孢杆菌蛋白质组分析的双向电泳方法.     

茭白总蛋白质双向电泳技术体系的建立

为建立茭白总蛋白质双向电泳技术体系,研究了TCA/丙酮沉淀法和改良酚抽法两种不同总蛋白质提取方法、蛋白质上样量、pH值范围及凝胶质量浓度等条件对2-DE的影响。结果表明,改良酚抽法更适合茭白总蛋白质的提取,采用17 cm、pH 4~7的胶条、1.0 mg的蛋白质上样量、12 g/dL的凝胶浓度、考马斯亮蓝G-250胶体考染法染色,最终可获得蛋白质点较多,背景清晰,分辨率较高的2-DE图谱,为进一步开展茭白差异蛋白质组学研究奠定了基础。     

人胰液双向凝胶电泳分离技术的建立和优化

目的建立并优化人胰液蛋白质组的双向凝胶电泳分离方法。方法通过比较几种常用的体液处理方法,确定了一种适于人胰液的蛋白质样品处理方法。经过一维等电聚焦和二维SDS-PAGE电泳后,有效分离了人胰液蛋白质组。结果通过优化胰液蛋白质提取、上样量和固相IPG胶条分离范围的选择等步骤,建立了人胰液双向凝胶电泳的方法,并获得了分辨率较高、重复性较好的双向凝胶电泳图谱。结论丙酮沉淀与双向凝胶电泳技术的结合是研究人胰液蛋白质组的一种有效的方法。胰液双向凝胶电泳方法的优化可为今后开展疾病相关的胰液蛋白质组学研究提供技术基础。     

羟基自由基氧化体系对乳清蛋白、β- 乳球蛋白化学结构的影响

本实验主要研究乳清蛋白(WPI)和β-乳球蛋白(β-Lg)经过FeCl3/抗坏血酸(AsA)/H2O2产生的羟基自由基氧化系统氧化后化学结构产生的变化。两种蛋白分别经过0.1mmol/L 或者1mmol/L FeCl3 氧化1、5 和12h 后,总巯基、游离氨都下降,而羰基、二聚酪氨酸和疏水性都呈增加的趋势。低Fe3+ 浓度氧化1h,WPI 巯基含量降低38.5%,β-Lg 降低11.6%;而游离氨分别降低20.68% 和0.64%。高Fe3+ 浓度氧化5h,WPI 羰基增加32.4%,β-Lg 增加8.4%;二聚酪氨酸分别增加132.4% 和28%;疏水值增加161.1% 和0.7%。高Fe3+ 浓度带来的氧化效果要比低Fe3+浓度明显(p ＜ 0.05)。这说明,氧化改变了蛋白的化学结构,氧化程度取决于浓度Fe3+ 的浓度,且β- 乳球蛋白比乳清蛋白有更好的稳定性。     

羟自由基氧化对高白鲑肌原纤维蛋白降解的影响

为了探究羟自由基氧化对鱼肉宰后贮藏期间肌肉蛋白降解的影响,以高白鲑为研究对象,取其背部肌肉进行氧化,研究羟自由基氧化对高白鲑肌原纤维蛋白降解的影响。设置4 组不同浓度的氧化体系（1 mmol/L H2O2＋0.2 mmol/L FeCl3、5 mmol/L H2O2＋0.4 mmol/L FeCl3、10 mmol/L H2O2＋0.8 mmol/L FeCl3、20 mmol/L H2O2＋1.0 mmol/L FeCl3）,并分别室温氧化0、15、30、60、90 min,以羰基含量确定最适氧化浓度和时间;氧化样品于4 ℃贮藏,分别在0、1、7、14 d取样,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹检测肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）、肌动蛋白、肌间线蛋白和肌钙蛋白T等蛋白的降解程度。结果表明：5 mmol/L H2O2＋0.4 mmol/L FeCl3的氧化浓度下孵育60 min为本实验最适氧化条件;氧化组MHC的降解率比未氧化组高,羟自由基氧化显著促进了MHC的降解（P＜0.05）;肌动蛋白变化不显著（P＞0.05）,自然降解占主导地位;氧化组中肌间线蛋白和肌钙蛋白T的降解率低于未氧化组,羟自由基氧化抑制了肌间线蛋白和肌钙蛋白T的降解。综上所述,羟自由基氧化主要促进肌纤维中粗丝蛋白的降解,对细丝蛋白的降解没有明显影响,对细胞骨架蛋白和连接蛋白的降解起到抑制作用。     

氧化胁迫对猪肉内源酶及保水性的影响

采用羟自由基氧化模拟体系（FeCl3-VC-H2O2）对猪肉背部最长肌进行了体外氧化模拟,探讨氧化胁迫对猪肉保水性机制的影响。结果表明,当H2O2浓度小于1 mmol/L时,离心损失率、羰基含量、内源荧光色谱、钙转运ATP酶表达量等指标无明显变化,随着H2O2浓度继续增大,各指标开始出现相对明显的差异。特别是当H2O2浓度大于10 mmol/L时,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）结果显示蛋白的交联及降解明显增加,扫描电子显微镜结果显示肌束纤维间的间隙明显增加。此外,当H2O2浓度大于10 mmol/L时,猪肉的钙转运ATP酶表达量增加,在20 mmol/L时达到最大值,同时,组织蛋白酶L的表达量显著减小,在20 mmol/L时达到最小值。高H2O2浓度（＞10 mmol/L）会导致猪背部最长肌的内源酶表达量显著变化,显著增加猪肉蛋白质的氧化降解程度,从而影响其微观结构,导致肉的保水能力下降。     

Two-dimensional gel electrophoresis of proteins and peptides in bovine milk

Proteins and peptides in bovine milk and colostrum were separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The proteins were separated in the first dimension by isoelectric focusing in the pH ranges 4–7 and 6–11, and in the second dimension by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis on 12.5% T homogeneous gels. The peptides were separated in the pH range 3–10 in the first dimension, while 15% T homogeneous gels were used in the second dimension. 2-DE evaluation of samples with various somatic cell counts showed an increased number of peptides with increased cell count. 2-DE analysis of samples heated at 65 and 85 °C for 30 min showed a decrease in the number of proteins and peptides with increased temperature. Colostrum exhibited a peptide pattern in which the intensity and number of spots decreased with time postpartum. These results show that 2-DE is a useful tool to detect variations of proteins and peptides in milk.     

芬顿氧化体系处理对白斑狗鱼肌原纤维蛋白结构和功能特性的影响

研究芬顿氧化体系诱导的不同氧化水平(0、1、5、10、20?mmol/L?H2O2)对白斑狗鱼肌原纤维蛋白结构和功能特性的影响.随着氧化水平的升高,肌原纤维蛋白的羰基和浊度增加、溶解度显著降低(P<0.05).十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示氧化后的肌原纤维蛋白中产生更多交联和蛋白质聚合.傅里叶变换红外光...