抗副溶血弧菌OMPK单克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测方法建立

制备全长和截短的弧菌外膜蛋白K（outer membrane protein K,OMPK）,纯化后的OMPK免疫6～8 周雌性BALB/c小鼠,间接夹心酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测小鼠的血清效价,结果表明全长OMPK重组蛋白制备的血清效价是截短OMPK1重组蛋白制备血清效价的128 倍。通过全长的OMPK重组蛋白制备多株用于检测副溶血弧菌的单克隆抗体,用生物素（biotin）和辣根过氧化物酶对单克隆抗体进行标记。间接夹心ELISA实验结果表明：只有VP3-biotin和VP16-biotin与其他单克隆抗体配对检测不同的副溶血弧菌菌株表现出较高的灵敏度及良好的特异性,并且在检测其他种属20 株菌时无交叉反应。VP16(Fab)-biotin/VP3检测副溶血弧菌时较VP16-biotin/VP3具有更高的灵敏度,该方法用于检测海鲜样品时,VP16-biotin/VP3检测三文鱼（5～10 CFU/25 g）和血蚶样品为副溶血弧菌阳性。本研究开发了一种快速、灵敏、简便的副溶血弧菌间接夹心ELISA检测方法。     

外膜蛋白OmpU对副溶血弧菌耐药性的影响

为了研究外膜蛋白OmpU对副溶血弧菌耐药性的影响,作者构建了副溶血弧菌中高丰度外膜蛋白OmpU缺失的突变株ΔompU。通过最小抑菌浓度（MIC）检测发现ΔompU对12种抗生素的耐药性发生变化,其中对氨苄青霉素的耐药性增加幅度最高。定量反转录PCR显示,在氨苄青霉素刺激下,野生型副溶血弧菌与ΔompU中肽聚糖合成基因转录水平普遍下调,而编码β内酰胺酶的基因VP＿RS17515在野生型中转录水平高于ΔompU。结果表明,副溶血弧菌通过表达β内酰胺酶并降低肽聚糖合成速度的方式应对氨苄青霉素刺激,而OmpU通过改变细胞膜通透性来影响氨苄青霉素的渗入。     

副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008和弧菌铁蛋白受体的重组表达及抗体交叉反应

目的:副溶血性弧菌特异性表面抗原对副溶血性弧菌免疫检测具有重要意义,目前外膜孔蛋白VP1008（39.3 kDa）和弧菌铁蛋白受体（78.7 kDa）的免疫原性仍不清楚。方法:从基因组DNA扩增了目的基因,分别构建了含目的基因的pET-28a（+）重组质粒,转入大肠杆菌BL21并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达两种重组蛋白。采用镍柱纯化的重组蛋白分别免疫了BALB/c小鼠,并通过酶联免疫吸附反应（ELISA）和免疫印迹研究了小鼠多抗与不同株副溶血性弧菌、其它弧菌等菌株的交叉反应。结果:重组蛋白VP1008和弧菌铁蛋白受体均以包涵体形式表达,小鼠多抗与免疫的重组蛋白的效价>1000 K,与7株副溶血性弧菌的效价在4.5~13.5 K,与10株弧菌基本无交叉反应,与肠杆菌的交叉反应和纯化过程中大肠杆菌蛋白的微量残留有关;多抗均与副溶血性弧菌全菌蛋白在目标位置出现反应条带,其中VP1008多抗效价和免疫原性相对较好。结论:外膜蛋白VP1008小鼠多抗对副溶血性弧菌识别性、免疫原性较好,为建立新的副溶血性弧菌免疫检测方法奠定了基础。     

基于分子对接的副溶血弧菌外膜蛋白OmpW天然抑制剂的筛选

为了筛选更加高效、无毒、绿色的副溶血弧菌抑制剂,以副溶血弧菌外膜蛋白OmpW作为受体,利用分子对接方法筛选具有潜在抑菌作用的天然小分子,选用对接结果较理想的柠檬酸和咖啡酸进行试验验证.在测定最小抑菌浓度的基础上,研究去外膜和去壁的副溶血弧菌对小分子敏感性及杀菌曲线的变化,分析外膜蛋白OmpW是否为柠檬酸和咖啡酸的作用位...     

创伤弧菌外膜蛋白VuuA的表达纯化及复性

对创伤弧菌重组外膜蛋白VuuA进行表达纯化及复性,以获得可溶性VuuA蛋白。构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a-vuuA,利用IPTG诱导表达重组蛋白VuuA,利用亲和层析分离纯化蛋白并对包涵体进行复性。VuuA蛋白主要以包涵体形式存在于重组工程菌细胞内,经复性后和亲和层析纯化后,蛋白浓度达到28.2mg/L发酵液,有效提高可溶性蛋白的浓度。VuuA蛋白的纯化及复性为创伤弧菌新型疫苗的制备奠定了基础。     

弧菌外膜蛋白Ompk基因序列分析及其多克隆抗体的制备

弧菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）OmpK不仅可激发机体的体液免疫和细胞免疫,而且可在不同血清型菌株之间产生免疫交叉反应。本研究利用克隆测序和查找GenBank获得20 株弧菌的Ompk基因序列并构建Ompk系统进化树,对比分析20 株弧菌Ompk基因序列;利用原核表达系统表达野生株Vibrio parahaemolyticus B的OmpK,纯化OmpK后制备兔多克隆抗体;采用酶联免疫吸附分析法和蛋白质印迹法（Western-blotting）分别检测抗体效价和特异性。系统进化树和基因序列比对结果显示Ompk基因在弧菌中高度保守,核苷酸序列相似性在77%以上;原核表达系统成功表达了弧菌OmpK,蛋白经纯化后成功制备的兔多抗效价达1∶16 000;Western-blotting实验证实抗体具有很好的特异性;OmpK多克隆抗体在弧菌中普遍存在免疫交叉性。因此,弧菌Ompk基因序列分析及其抗体研制,不仅为弧菌快速免疫学检测提供可能性,也为以OmpK为靶点的水产疫苗研制奠定了基础。     

副溶血弧菌TDH的原核表达及单克隆抗体的制备

为实现副溶血性弧菌tdh基因的原核表达,采用TCBS选择培养基从贝类中筛选副溶血性弧菌疑似菌株;根据Gen Bank上已有的tdh基因序列,设计并人工合成引物,通过PCR技术鉴定副溶血性弧菌并扩增tdh基因;酶切后定向插入到p ET-28a表达载体中,构建重组表达质粒p ET-28a-tdh,转入E.coli Rosetta中,在IPTG诱导下进行TDH蛋白表达。为制备耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,用纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功用原核载体表达的TDH蛋白为免疫原,制得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为T9N10。获取腹水并经Ni-NTA Resin亲和柱纯化,其稳定分泌的单克隆抗体经鉴定为Ig G1,相对分子质量约为146 000,并表现出较强的特异性。本研究为开发副溶血弧菌免疫学快速检测和深入的研究奠定良好的物质基础。     

新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的 制备新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。方法 根据公布的新冠病毒全基因组序列,构建其核衣壳蛋白的表达载体pET-28a-N, 并转化至E. coil BL21(DE3)进行原核表达, ELISA及Western blot鉴定纯化后的核衣壳蛋白重组抗原的特异性并免疫Balb/c系小鼠, 基于杂交瘤融合技术筛选获得可持续分泌新冠病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的细胞株, 并基于ELISA及生物膜层干涉技术鉴定单克隆抗体的特异性和亲和力。结果 基于大肠杆菌原核表达获得新冠病毒核衣壳蛋白的重组抗原, 其纯度大于90%, 筛选获得7株可分泌特异性结合新冠病毒核衣壳蛋白的杂交瘤细胞株, 经Western blot、ELISA及分子相互作用分析等方法证实所获得的单克隆抗体与核衣壳蛋白具有优良的结合特异性和结合活性, 其中的7E11、7E8单克隆抗体与核衣壳蛋白抗原的亲和力常数分别为1.69×10-9、2.031×10-9M, 可作为抗体元件应用于新冠病毒的快速免疫分析领域。结论 获得高特异性的新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。     

三聚氰胺单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

采用牛血清白蛋白偶联的三聚氰胺( melamine- BSA)完全抗原免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术制备抗三聚氰胺的特异性单克隆抗体.所得单克隆抗体效价可达5.0×105,且抗体的亚类类型为IgG1,抗体的亲和常数为3.21×109 L/mol.与三聚氰酸、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺的交叉反应率分别为30％、93％和46％.说明该单抗可用于三聚氰胺类物质的检测,为研制高质量的三聚氰胺ELISA试剂盒和胶体金试纸条奠定了基础.     

副溶血性弧菌毒性相关因子及其外分泌蛋白的研究进展

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌,已成为我国沿海地区微生物性食物中毒事件的首要风险因子。该菌主要通过分泌胞外蛋白和毒性因子进入胞外环境或者直接注入宿主靶细胞内,从而使宿主致病。本文主要从副溶血性弧菌毒性相关因子及其分泌系统相关分泌蛋白进行概述,概括阐明近年来针对该菌毒性及分泌蛋白的相关研究进展,并对今后分泌蛋白的研究方向进行了初步探讨。     

芝麻过敏原油质蛋白O leosins单克隆抗体的制备与鉴定

利用细胞融合技术制备小鼠抗油质蛋白杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。获得10株杂交瘤细胞,分别命名为1B2、2D8、2F3、3A4、3D7、3F8、4A10、4F12、6A12、6E7,利用Ig亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的Ig亚型,除1B2、3D7、3F8为IgG1类外其余均为IgG2a类型。将杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔获取腹水,应用Protein A亲和层析法对腹水进行纯化。单抗效价有9株在2.0×105以上。ELISA和Western blotting分析表明这些单抗均能特异性识别芝麻过敏原油质蛋白。     

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及免疫学鉴定

通过碳化二亚胺法(EDC法)制备免疫原OTA-BSA,并免疫小鼠,经杂交瘤技术建立产抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株。通过体内诱生腹水法制备腹水,纯化后对其亚型、效价、灵敏性、亲和性、特异性等免疫学特性进行鉴定;单抗亚类为IgG1型,间接ELISA效价1:6.4×105,IC50为112.8pg/mL,亲和常数为9.74×1011L/mol,与赭曲霉毒素B交叉反应率为5.6%,与其他常见真菌产物交叉小于0.003%;本实验制备的抗OTA单克隆抗体具有高效、敏感、特异等特点,适合OTA的免疫学快速检测。     

抗Cry1c蛋白兔单克隆抗体的制备和鉴定

通过原核质粒表达重组Cry1c晶体蛋白,将其纯化后作为特定抗原免疫兔子。经多抗血清效价的测定,细胞融合,杂交瘤细胞的筛选,构建重组载体等步骤获得抗Cry1c单克隆抗体。通过ELISA方法测定单克隆抗体相关特性,结果表明,Cry1c兔单克隆抗体效价超过3.2×104,其亲和常数为2.4×109L/mol,该单克隆抗体与Cry1Ac蛋白有微量交叉反应,与Cry1Ab蛋白无明显交叉反应。间接ELISA检测抗原Cry1c蛋白时,当包被量为400ng/mL时,判定为阳性。     

苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA 检测

重氮法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物,通过活性酯法将苏丹红Ⅰ的结构类似物偶联到载体蛋白上制备人工抗原,用所制备的人工抗原免疫BALB/c 小鼠,采用细胞融合的方法制备苏丹红Ⅰ单克隆抗体,结果成功筛选到一株抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体,经鉴定为IgG2a 型,并建立间接竞争ELISA 检测方法,线性范围为0.5～10ng/mL,检测下限为0.1ng/mL,加标回收率为52.3%～110%,变异系数为3.2%～8.9%。     

呋喃西林代谢物单克隆抗体的制备及免疫学特性鉴定

为建立呋喃西林代谢物氨基脲（semicarbazide,SEM）的免疫学检测方法,采用碳化二亚胺法成功合成人工免疫抗原SEM-牛血清白蛋白（bovine serum albumen,BSA）（SEM-BSA）,并用该抗原免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇介导的细胞融合技术制备SEM的单克隆抗体（SEM mAb）,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗,并对其效价、敏感性、特异性和亲和力等免疫学特性进行鉴定。结果表明：成功制备SEM单克隆抗体SEM-3D9,抗体效价达到1∶5×106,敏感性半抑制质量浓度为0.42 μg/L,亚型为IgG1,亲和常数Ka=2.1×108 L/mol,与呋喃唑酮代谢物2-NP-3-氨基-2-恶唑酮、呋喃它酮代谢物2-NP-5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮类似物的交叉反应率（cross reaction,CR）均小于0.01%,与呋喃妥因代谢物2-NP-1-氨基-2-乙内酰的CR为0.016 8%,特异性良好。     

有机磷农药三唑磷单克隆抗体制备及鉴定

采用活泼酯法和混合酸酐法将三唑磷半抗原(TZPM-Hap)与牛血清蛋白(BSA)和卵血清蛋白(OVA)偶联,分别制备出一种免疫抗原(TZPM-A-BSA)和两种包被抗原(TZPM-A-OVA和TZPM-M-OVA)。通过免疫小鼠及细胞融合,并对杂交瘤细胞进行经多次筛选和亚克隆得到1株产三唑磷单克隆抗体阳性细胞株(FC3),其抗体亚类为IgM。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后的抗体经间接ELISA检测,该方法IC50=9.7μg/L,最低检测限(LOD)为1.0μg/L,定量检测线性范围(IC20～IC80)为2.5～100.0μg/L,与其他有机磷农药结构类似物无明显交叉反应,显示出高度的特异性。该抗体可进一步用于免疫分析试剂盒开发。