双齿围沙蚕抗凝血肽的制备及其抗血栓作用

目的:探讨双齿围沙蚕抗凝血肽(anticoagulant peptides from Perinereis aibuhitensis,PAAP)的制备及其抗血栓作用。方法:以抗凝活力为检测指标,筛选最佳酶对沙蚕进行酶解。酶解产物经超滤、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱法分离纯化,得到具有最强抗凝活力的沙蚕寡肽,将此肽命名为PAAP并测定其急性毒性作用。采用角叉菜胶所致的小鼠尾部血栓形成实验、三氯化铁所致的大鼠动脉血栓形成实验及二磷酸腺苷(adenonisine disphosphate,ADP)诱导的血小板聚集实验,研究PAAP的抗血栓作用。结果:选取碱性蛋白酶作为最佳酶对沙蚕进行酶解,经过分离纯化后得到一条氨基酸序列:脯氨酸-缬氨酸-谷氨酸-精氨酸-赖氨酸(Pro-Val-Glu-Arg-Lys)。经测定,该寡肽的体外抗凝活力可达(1 320.0±20.3)U/g。PAAP的最大耐受量为11.0 g/(kg·d)且未出现小鼠异常及死亡现象,体内实验表明PAAP对小鼠尾部血栓的形成、大鼠动脉血栓的形成及ADP诱导的血小板聚集均有明显抑制作用。结论:从双齿围沙蚕中提取出的抗凝肽PAAP具有抗血栓作用。     

双齿围沙蚕美拉德反应产物的制备及其抗氧化活性初探

利用酸解法水解双齿围沙蚕干品得到氨基酸水解液,再分别与葡萄糖、蔗糖进行美拉德反应制备美拉德反应产物(MRPs),采用硫氰酸铁法研究其抗氧化活性。结果表明:制备得到的两种沙蚕美拉德反应产物均具有一定的抗氧化活性。在受试时间内,沙蚕和葡萄糖MRPs的抗氧化活性在作用4h之前弱于没食子酸丙酯,在作用4h之后优于没食子酸丙酯;而沙蚕和蔗糖MRPs的抗氧化活性在受试7.5h以内弱于没食子酸丙酯,且其抗氧化活性呈逐渐减弱的趋势,而在7.5h以后其抗氧化活性呈现增强的趋势。      

双齿围沙蚕美拉德反应产物的制备及其抗氧化活性初探

利用酸解法水解双齿围沙蚕干品得到氨基酸水解液,再分别与葡萄糖、蔗糖进行美拉德反应制备美拉德反应产物（MRPs）,采用硫氰酸铁法研究其抗氧化活性。结果表明：制备得到的两种沙蚕美拉德反应产物均具有一定的抗氧化活性。在受试时间内,沙蚕和葡萄糖MRPs的抗氧化活性在作用4h之前弱于没食子酸丙酯,在作用4h之后优于没食子酸丙酯;而沙蚕和蔗糖MRPs的抗氧化活性在受试7.5h以内弱于没食子酸丙酯,且其抗氧化活性呈逐渐减弱的趋势,而在7.5h以后其抗氧化活性呈现增强的趋势。     

双齿围沙蚕的工厂化育苗

阐述了沙蚕工厂化育苗试验的结果,说明在现有的对虾育苗池中能够进行沙蚕的育苗,且1m~3水体出苗可达21万尾,为沙蚕的大规模人工增养殖提供试验研究。     

双齿围沙蚕β-1,3-葡萄糖苷酶分离纯化及其酶学性质

从双齿围沙蚕中提取、分离纯化β-1,3-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。通过80%饱和度（NH4）2SO4沉淀从双齿围沙蚕中得到粗β-1,3-葡萄糖苷酶,粗酶依次经DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析进行分离纯化。酶纯化倍数为35.74,回收率为39.49%。SDS-PAGE检测表明其分子量为28.7 k Da。该酶最适温度为50℃,最适p H为7,Km为8.2×10-4mol/L,Vmax为3.2×10-4μmol/h。金属离子K+、Mg²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺对β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力影响较小,Al³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ag⁺对β-1,3-葡萄糖苷酶酶活力抑制较大,其中Zn²⁺抑制作用最强。双齿围沙蚕可作为β-1,3-葡萄糖苷酶的潜在来源。      

沙蚕活性蛋白酶诱导人肺癌SPC-A-1细胞凋亡的机制研究

本文探讨了沙蚕活性蛋白酶(Nereis active protease,NAP)诱导SPC-A-1细胞凋亡机制。采用MTT法检测NAP对SPC-A-1细胞的抑制作用,倒置显微镜及AO/EB染色观察SPC-A-1细胞的形态学的变化,采用流式细胞术检测细胞早期凋亡率和细胞膜电位的变化;并通过Western Blotting检测细胞中凋亡相关蛋白的表达变化。NAP对SPC-A-1细胞活性具有明显的抑制作用且呈现剂量和时间的依赖性;NAP作用后细胞出现凋亡的形态学特征;经流式细胞术检测结果显示,随着NAP作用浓度的增加,SPC-A-1细胞的早期凋亡率从13.50%提高到22.98%,且线粒体膜电位下降所占的百分率从12.95%提高到25.28%。Western Blotting结果显示,50μg/mL NAP作用24h后,Bax/Bcl-2的比率相对对照组明显增加了6.05倍;Cyt-C、Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP等含量显著上调,相对表达量分别达到对照组的2.32、3.07、3.68、1.36倍。NAP诱导SPC-A-1细胞凋亡的作用机理有可能是通过下调Bcl-2蛋白的表达、上调Bax蛋白的表达,进而诱导线粒体膜电位的下降,促使Cyt-C的转移以及激发Caspase家族发生级联反应最终导致SPC-A-1细胞的凋亡。     

食用色素藻蓝蛋白对非小细胞肺癌A549细胞体外增殖和凋亡的影响

本研究以人类非小细胞肺癌A549细胞系为模型,采用藻蓝蛋白处理体外培养的细胞,分别从细胞存活率、细胞形态、细胞凋亡程度以及周期分布4?个方面阐述了藻蓝蛋白对A549细胞的影响。结果表明,藻蓝蛋白能够显著降低A549细胞的存活率与生长速率（P＜0.05）,引起细胞形态发生非正常改变;同时上调促凋亡基因Bax、Bad,下调抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的表达而诱导细胞凋亡;此外,藻蓝蛋白能够异常调控细胞周期G1/S转换点相关基因的表达而引起细胞发生G1期阻滞。研究结果揭示了藻蓝蛋白对A549肺癌细胞具有显著的抑制作用,为开发新型抗癌类功能性食品着色剂提供了必要的理论依据。     

硒酸壳聚糖通过线粒体途径诱导A549细胞凋亡的初步研究

本文研究了硒酸壳聚糖(SC)对非小细胞肺癌A549增殖抑制及诱导凋亡作用,并进一步研究了SC对其凋亡前后蛋白差异表达。采用MTT法检测了SC对A549细胞的增殖抑制作用;并用激光共聚焦分别观察了Hoechst33342/PI染色后A549细胞形态的变化以及钙黄绿素染色后细胞线粒体MPTP的开放状况;流式细胞仪检测了SC对A549细胞线粒体跨膜电位的影响;利用2-DE结合MALDI-TOF质谱技术检测了细胞凋亡相关蛋白的差异表达。结果表明:SC对A549细胞具有显著的增殖抑制作用,并在一定范围内呈现时间和浓度依赖性;SC可使A549细胞发生形态改变,使细胞变得不规则,染色质固缩和边集;经SC处理后,细胞的线粒体膜通道逐渐开放;经MALDI-TOF鉴定发现了2个差异表达的蛋白,即抗增殖蛋白(prohibitin isoform 1),细胞内热休克蛋白(heat shock protein)。     

鱿鱼墨黑色素的提取及其对A549细胞的影响

为了探索鱿鱼墨黑色素提取物(SIME)对体外培养的A549细胞的抑制作用,研究了鱿鱼墨黑色素的提取、分离方法,并研究SIME对A549细胞活力及细胞迁移能力的影响。结果表明,SIME的最优提取条件为:提取温度100℃,料液比1∶30,提取时间1.5 h,碱液浓度1.0 mol/L。在此条件下SIME得率为20.13%。SIME提取物对A549细胞形态有一定影响,对细胞活性及细胞迁移能力均有一定抑制作用,且呈一定的量效关系。研究结果提示:SIME具有较强的抗A549肿瘤细胞的作用。本结果为鱿鱼墨高值化利用提供了理论依据。     

维生素C联合顺铂对肺癌A549细胞增殖、侵袭与凋亡的影响

目的探讨维生素C（VC）联合顺铂（DDP）对肺癌A549细胞增殖、侵袭与凋亡的影响。方法体外培养肺癌A549细胞,给予不同浓度（0.025、0.25、2.5 m M）VC联合5.0 mg·L^-1 DDP处理,采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测A549细胞的增殖情况,采用Transwell实验检测A549细胞的侵袭能力,采用碘化丙啶（PI）染色流式细胞术（FCM）检测A549细胞的凋亡率。结果 VC与DDP联合用药可显著抑制A549细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性,经VC与DDP联合处理的A549细胞,发生侵袭的细胞数目显著减少,细胞凋亡率显著升高。结论 VC与DDP联合用药可抑制肺癌A549细胞的增殖和侵袭能力,诱导细胞凋亡。     

皱瘤海鞘抗人肺癌A549细胞组分的分离纯化及化学成分分析

采用四氮甲唑蓝比色法检测皱瘤海鞘（Styela plicata）被囊及内脏团甲醇提取物对体外培养的人肺癌A549细胞增殖的抑制作用,利用倒置显微镜、流式细胞仪及荧光显微镜观察,分析其对A549细胞的形态和细胞凋亡的影响,并且用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）技术分析高活性组分6号内脏团柱层析组分（column eluted fraction 6 from visceral methanol extract,VCEF-6）的化学成分。结果表明：在低质量浓度（25～75 μg/mL）范围内,被囊及内脏团醇提物对A549细胞生长没有抑制作用,当质量浓度增大到100 μg/mL以上时,被囊及内脏团醇提物表现出对A549细胞明显的生长抑制作用。醇提物柱层析组分的体外抗肿瘤检测表明,共有8 个组分在100 μg/mL时对A549细胞表现出明显的生长抑制作用,其中VCEF-6抑制A549细胞生长活性最强,24 h时半数抑制浓度为168.7 μg/mL。通过流式细胞术以及荧光显微镜观察表明,VCEF-6抑制肿瘤细胞生长与诱导细胞凋亡有关。GC-MS分析VCEF-6的化学成分结果表明,VCEF-6含有22 种已知物质,其中甾醇类6 种、烷烃类6 种、脂肪酸酯类6 种、芳香族化合物4 种。综上所述,在体外实验中VCEF-6能够抑制A549细胞生长并诱导其凋亡。     

不同组分马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对人肺癌细胞A549作用的研究

本研究采用不同组分马尾藻岩藻聚糖硫酸酯（SF）对人肺癌细胞A549细胞的抑制作用进行了研究。根据MTT比色法检测不同细胞铺板数量及不同质量浓度SF对该细胞生长曲线的影响;不同组分SF在不同时间对该细胞的增殖抑制率;倒置显微镜下观察SF对该细胞形态的影响。研究结果表明,当SF的浓度在1²5mg/mL范围、细胞铺板数量为5×103个/mL时,细胞生长曲线线性良好;各组分SF对人肺癌细胞A549均有抑制作用,其中SF2-R对细胞的抑制效果较强,抑制率为61.06%。      

平盖灵芝提取物对肺腺癌A549细胞增殖抑制作用研究

目的探讨平盖灵芝不同极性部位提取物对肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用。方法采用噻唑蓝（MTT）法测定。结果平盖灵芝氯仿部位提取物高剂量组(100μg/mL)对肺腺癌A549细胞的增殖抑制率为30.43%,与空白组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论平盖灵芝氯仿部位提取物对肺腺癌A549细胞增殖有一定抑制作用,其有效成分及作用机制有待进一步研究。     

苦参多糖促人肺癌A549细胞的凋亡作用

探究苦参多糖对人肺癌细胞株增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。选取人肺癌A549细胞株,经过培养后分为空白组、药物对照组以及低、中、高浓度组,检测各组细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力,并对凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt表达进行测定。研究结果显示,72 h时高浓度组细胞增殖率为18.65%,凋亡率为79.55%,均优于其他各对照组。高浓度组细胞侵袭数、迁移数均低于其他各组（p<0.05）。高浓度组细胞Bcl-2、PI3K、Akt相对表达量分别为0.32、0.40、0.34,均低于其他各组（p<0.05）。在苦参多糖干预下,肺癌细胞增殖率下降,凋亡率上升,侵袭、迁移能力受到明显的抑制,凋亡相关蛋白Bcl-2、PI3K、Akt表达受到明显的调控,且其能力呈现明显的浓度依赖性,说明苦参多糖能够抑制肺癌细胞增殖、侵袭、迁移,促进肺癌细胞凋亡,为肺癌的临床治疗提供一定的理论依据。     

亚硒酸钠与白藜芦醇联合应用对肺癌细胞的协同效应分析

目的:观察亚硒酸钠与白藜芦醇单独及联合应用对肺癌细胞的影响,并通过细胞周期探讨其作用机理。方法:用四甲基偶氮唑盐法检测亚硒酸钠和白藜芦醇单独及联合应用对细胞增殖和存活的影响;用流式细胞术测定细胞的凋亡率及细胞周期。结果:亚硒酸钠和白藜芦醇对肺癌细胞A549均有拮抗作用,且随浓度的增加,拮抗效果越显著,当亚硒酸钠浓度大于等于5μmol/L时,拮抗效果极显著(P0.01);当白藜芦醇浓度大于等于65μmol/L时,拮抗效果极显著(P0.01)。亚硒酸钠对A549细胞的半致死率(lethal dose of 50%,LD_(50))为4.759μmol/L,白藜芦醇对A549细胞的LD_(50)为45.24μmol/L。然而亚硒酸钠和白藜芦醇联合用药作用于A549细胞的拮抗效果优于单独用药,且低剂量的亚硒酸钠和白藜芦醇联合就能发挥出高剂量亚硒酸钠对A549细胞的拮抗作用效果,有效地降低了亚硒酸钠对细胞的毒副作用。另外,亚硒酸钠联合白藜芦醇作用可以阻滞A549细胞G0/G1期,最终导致细胞凋亡。     

青蛤多肽的酶法制备及对前列腺癌DU-145细胞的抑制活性

探讨青蛤多肽的制备工艺及体外抗前列腺癌DU-145细胞的活性。以氨基氮含量为检测指标,筛选最优酶种类并进行正交试验以获取最佳酶解青蛤内脏酶解工艺。经超滤截留、琼脂糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化及噻唑蓝（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）活性筛选得到含有5 个氨基酸的多肽（Ile-Leu-Tyr-Met-Pro）。对所得多肽采用MTT法测定DU-145细胞增殖抑制率;采用倒置显微镜、Hoechst 33258染色及透射电子显微镜技术观察细胞形态学变化;采用荧光法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;采用线粒体膜电位检测DU-145细胞凋亡情况;采用免疫组织化学法检测非转移性克隆23型（nm23H1）蛋白的表达。结果表明：制备青蛤多肽最佳酶是木瓜蛋白酶,最佳酶解条件是料液比1:4、pH 7.0、加酶量1 500 U/g、温度45.0 ℃、酶解时间4 h;所得多肽对DU-145细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈时间与剂量依赖性;处理后的DU-145细胞出现凋亡的形态学特征;其质量浓度和细胞内ROS的表达量呈正相关关系;线粒体膜电位降低率从4.22%提高到25.07%;免疫组织化学法结果显示nm23H1蛋白的表达量增加。青蛤多肽能明显抑制DU-145细胞的增殖,并通过诱导其发生凋亡而发挥作用。