巨细胞病毒感染PCR检测方法的建立

目的建立检测巨细胞病毒污染的PCR检测方法,并制备检测试剂盒。方法采用TaqMan探针,选择保守序列CMV-pp65设计引物,荧光定量病毒载量;对试剂盒进行敏感性、重复性和特异性等测试;对31份临床阳性血清标本和106份正常献血者血浆标本进行检测,并与国内同类试剂盒进行比较。结果该试剂盒检测线性定量范围可达202~3.6×109copies/ml,敏感性为360copies/ml,CV值在1%左右,特异性高,临床标本检测的符合率为100%。本试剂盒与国内已上市试剂盒比较,具有较好的相关性、更高的敏感性和更宽的定量检测范围。结论制备的试剂盒特异性和敏感性均较高,适用于临床上的病毒检测。     

荧光定量PCR与焦磷酸测序联合应用检测异烟肼、利福平耐药性结核分枝杆菌

目的联合运用荧光定量PCR和焦磷酸测序技术快速检测异烟肼、利福平耐药性结核分枝杆菌。方法收集结核病疑似患者痰液样本,提取样本总DNA,运用Taqman荧光定量PCR对结核分枝杆菌的感染进行快速筛查。对检测结果为阳性的样本,采用焦磷酸测序法分别对异烟肼、利福平耐药结核分枝杆菌相关基因katG、rpoB的突变热点进行测序分析,与标准菌株序列比对,判断结核分支杆菌异烟肼、利福平的药敏性。采取Bactec 960药敏法鉴定结核分枝杆菌耐药性,并与焦磷酸测序法药敏检测结果进行比较,评估焦磷酸测序法的可靠性。结果荧光定量PCR技术检测痰液样本结核分枝杆菌的准确率达98.95%,检测时间约3 h;以Bactec 960药敏法鉴定结果为标准,焦磷酸测序法对结核分枝杆菌异烟肼、利福平的药敏鉴定结果准确性分别达93.75%和96.15%,其中,对耐药菌株判断,两种方法的一致性高达98%。结论采用荧光定量PCR检测技术可快速、准确地进行结核分枝杆菌感染筛查,运用焦磷酸测序技术则可快速准确地筛查出耐药样本,从痰液样本采集到结核分枝杆菌感染筛查以及药敏报告发布,全程仅需7 h;耐药菌株的检测可靠性达98%。     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

土壤中的硝态氮检测试纸的制备及应用

根据NO-2氧化碘离子为单质碘,而碘遇淀粉显色这一反应特性,通过改变模拟土壤浸提液的pH值、催化剂用量、反应时间等还原浸提液中的硝态氮,探索出制备淀粉碘化钾试纸的最佳条件,并制作出标准色阶谱图。实验以分光光度法为验证手段,试纸法测量的土壤硝态氮含量与仪器检测结果基本吻合,且其它共存离子对显色几乎没有影响。     

实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

目的建立实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。方法采用双标准曲线法,分别利用含有GAP基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线。将含有外源GFP基因的毕赤酵母基因组进行实时荧光定量PCR,通过标准曲线计算出外源GFP基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。结果毕赤酵母GAP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.612x+39.28,GFP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.544x+37.99,GAP基因和GFP基因的反应效率分别为0.89和0.90,两条标准曲线的相关系数均为0.999,且均有良好的重复性。检测10个转入GFP基因的毕赤酵母菌株,筛选到9个单拷贝整合GFP基因的菌株和1个多拷贝整合GFP基因的菌株。结论已建立了检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR法,该方法能够筛选出不同外源基因拷贝数的毕赤酵母菌株。     

实时定量PCR检测食品中单核细胞增生性李斯特氏菌

单增李斯特氏菌广泛存在于肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等食品中,其中毒严重的可引起血液和脑组织感染。本研究通过实时荧光定量PCR及常规方法对2份单增李斯特氏菌进行能力验证,旨在检验我院检测能力,进而提升我院的综合实力。荧光定量PCR检测单增李斯特氏菌较常规方法更加灵敏、简便和快速!     

甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒的制备

目的制备甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,并进行验证。方法采用磁珠法从甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品中提取病毒RNA,逆转录合成cDNA。根据NCBI最新公布的大流行甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列,设计针对编码基质蛋白M基因的引物和探针,检测甲型流感病毒;设计针对血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因特异性的引物和探针,检测甲型H1N1流感病毒;同时针对人的RNaseP基因设计用于内部控制的引物和探针。所有探针均为Taqman探针,5'端标记FAM,3'端标记BHQ1。对最佳荧光PCR反应条件进行优化,在此基础上组装成甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,对其特异性、灵敏度、精密性和稳定性进行验证。与市售试剂盒的检测结果进行对比,并对63份临床甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品进行检测。结果设计的PCR引物及探针能对甲型H1N1流感病毒进行准确检测,与流感病毒的其他型和亚型无交叉反应;试剂盒的灵敏度为0.004个血凝素单位;试验内变异系数小于2.5%,批间变异系数小于5%;试剂盒放置-20℃保存,稳定性良好;检测20份甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品的结果与市售试剂盒一致;检测63份流感疑似患者咽拭子样品,其中大流行甲型H1N1流感病毒阳性36份,普通甲型流感病毒阳性5份。结论所制备的甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒具有较高的灵敏度、特异性、精密性和稳定性,可用于目前流行的甲型H1N1流感病毒的快速检测。     

基于微生物学的速食食品致病菌检验研究

分析基于微生物学的速食食品致病菌检验检测结果,总结相应的检验方法.采用传统细菌分离培养法和实时荧光定量PCR法进行检验.对两种检验方法下的致病菌阳性检出情况进行统计,计算出总阳性率.并对两组检验所耗费的时间进行记录,计算出平均用时结果.经统计与组间比较,实时荧光定量PCR法的样本阳性检出率为11.00％,较传统细菌分离...     

一种新的核酸自动化提取方法在病原体检测中应用的评价

目的评价一种新的核酸自动化提取方法在病原体检测中的应用。方法分别用试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)和核酸自动提取仪Genolution NX-48平行提取同一批104份临床咽拭子样本,利用商业化的RespiFinder SMART22多重荧光PCR检测试剂盒和甲型流感病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒,比较两种核酸提取方法对不同病原体检出率及甲型流感病毒最低检测限的影响。结果临床咽拭子样本经两种方法提取核酸后用于呼吸道多病原检测,结果具有高度一致性(Kappa 0. 60)。可检出19种呼吸道病原,包括DNA病毒、RNA病毒及非病毒病原,其中检出率较高的病原为鼻病毒/肠道病毒(rhinovirus/enterovirus,Rhino/Entero)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、甲型流感(influenza A,InfA)病毒及腺病毒(adenovirus,Adeno)。QIAamp Viral RNA Mini Kit及核酸自动提取仪Genolution NX-48提取的甲型流感病毒的最低检测限为1. 36×10~0和1. 41×10~1 PFU/m L,差异无统计学意义(P 0. 05)。结论核酸自动提取仪Genolution NX-48应用性能良好,提取核酸省时、快捷、成本低,结合RespiFinder SMART22多重荧光PCR检测试剂盒,可进行临床和实验室大量样本的核酸快速提取及呼吸道多病原检测。     

分光光度法测定离子膜工艺精盐水中的碘

借鉴水质分析中分光光度法测定微量碘的分析方法,建立了精盐水中碘的分析方法。方法的原理为碘离子与碘酸根的定量反应,用碘化钾-淀粉体系显色测定碘含量。通过试验明确了检测步骤的影响因素。试验表明：恰当的磷酸与甲酸钠加入量能够满足显色要求,无需依照原方法的规定,加热至沸去除甲酸钠,因此显色之前也无需再次调节酸度。本文建立的方法采用磷酸体系,保持pH值在2.5～3.5之间,方法检出限5μg/L,线性范围5～500μg/L, RSD小于10%,回收率在80%～110%。本方法全程无需加热,比借鉴方法大为节省时间,方法的检出限和精密度都能够满足现场快速检定的要求。     

黑曲霉实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立黑曲霉实时荧光PCR检测方法。方法对6种主要病原曲霉(黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉)的GAPDH基因序列进行比对分析,选择黑曲霉特异位点设计引物和探针,对黑曲霉进行实时荧光PCR扩增,并检测该方法的灵敏度及特异性。结果该方法可检出2.78×10-10μg/ml的黑曲霉基因组DNA;对亲源关系较近的11株不同种曲霉及4株其他属临床常见的病原真菌进行实时荧光PCR检测,未发现有交叉反应。结论已建立了灵敏度高、特异性好的快速检测黑曲霉的实时荧光PCR方法。     

比较分析痰涂片及荧光定量PCR在诊断肺结核中的作用

目的探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法采用痰涂片抗酸染色法和荧光定量PCR技术对痰结核分枝杆菌进行检。结果荧光定量PCR技术的阳性检出率是63.7%(571/897),明显高于抗酸染色法的43.4%(389/897)。2种方法检测对照组的结果均为阴性,特异度为100%(103/103)。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有重要的应用价值。     

绿豆源基因的实时荧光定量LAMP检测方法研究

针对绿豆转录间隔区设计一套引物,通过温度优化、特异性和灵敏度试验,建立一种绿豆源DNA的实时荧光定量环介导等温扩增(LAMP)检测方法。结果显示,实时荧光定量LAMP检测方法在温度为61℃时,引物能够将绿豆、大豆、玉米、木薯和马铃薯DNA区分开,灵敏度可以达到0.1pg·uL~(-1)。实时荧光定量LAMP方法能够快速有效地对绿豆源成分进行检测,为绿豆制品真实性检测提供了一种快速准确的检测方法。     

人源细胞间黏附分子-1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

目的建立并验证细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测不同细胞中ICAM-1的基因水平。方法根据GenBank中登录的ICAM-1基因序列设计并合成引物,建立ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法,验证方法的适用性、线性范围、灵敏性、特异性及精密性。同时采用该方法对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、人星形神经胶质瘤细胞(u251)、人原发性肝癌细胞(PLC/PRF/5)、人胚肾细胞(HEK293)及人脐静脉内皮细胞(HuvEc)进行检测。结果该方法的溶解曲线峰单一,无非特异性产物和引物二聚体;标准质粒在6. 74×10~4～6. 74×10~9 copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好的线性关系,线性方程为y=-3. 576 log x+42. 982,R~2=1. 000;建立方法的灵敏性是普通PCR法的10倍;该方法检测不同物种细胞无交叉反应,仅能检出人源细胞ICAM-1;批内和批间CV均1%。不同组织来源的细胞内ICAM-1基因含量不同,其中MRC-5细胞含量最高。结论成功建立了ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,且具有良好的特异性、灵敏性及精密性,可用于ICAM-1基因的定量检测。     

人干扰素诱导跨膜蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立人干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank中登录的人IFITM1、2、3及β-actin基因序列,分别设计4对特异性引物,以质粒pVAX1-IFITM1、2、3和pMD18-T-β-actin为模板,分别进行PCR及实时荧光定量PCR扩增,优化实时荧光定量PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线及扩增曲线,建立实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的重复性、灵敏度及特异性。结果各质粒的PCR及实时荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见大小与理论值相符的特异性条带。IFITM1、2、3和β-actin的最佳荧光定量PCR引物浓度分别为0.2、0.5、0.4和0.5μl,最佳退火温度为55℃。各质粒标准曲线的循环数与起始模板拷贝数的相关性均较好(R2分别为0.998、0.990、0.990和0.995),扩增效率分别为106.284%、101.030%、104.929%和101.962%。IFITM1、2、3基因不同拷贝数的试验内CV为0.14%-0.72%,试验间CV为0.77%-1.58%;灵敏度分别为2.52×100、1.3×100和3.7×101copies;该方法未扩增出鸡肝脏及禽流感病毒H3N2 cDNA,可特异性扩增B型流感病毒cDNA,各标准质粒的溶解曲线约在同一温度出现1个单峰。结论已成功建立了IFITM1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有较高的重复性、灵敏度及特异性,为进一步研究IFITM1、2、3的功能及其基因表达与肿瘤发生发展的相关性奠定了基础。     

牛副流感病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的Taq Man荧光定量PCR方法。方法根据GenBank中公布的BPIV3序列,选取P基因上保守区域设计特异性引物及TaqMan-MGB探针。优化反应体系,建立实时荧光定量PCR方法,并对方法的特异性、重复性和敏感性进行验证。结果标准曲线在104~108copies/μl范围内具有良好的线性关系,R~2达到0.999,斜率为-3.203,扩增效率为105.2%。利用该方法对BPIV3a及BPIV3c进行检测,结果为阳性,对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectioils bovine rhinotraeheitis virus,IBRV)进行检测,结果呈阴性。3个浓度质粒标准品,重复3次检测,CV均小于1.5%。建立的方法对质粒的最小检出量为1.0×10~2 copies/μl。结论建立了能够检测BPIV3a及BPIV3c的TaqMan-MGB探针实时定量PCR方法,该方法特异性较强,重复性及敏感性良好,为早期诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。     

酸碱“一步法”荧光PCR快速检测乙型肝炎病毒核酸

目的建立酸碱"一步法"荧光PCR快速检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)核酸。方法对建立的酸碱"一步法"荧光PCR中的核酸释放剂组分及其浓度、释放时间,PCR缓冲液的组分、p H值及防污染体系进行优化。验证该方法的灵敏度及线性范围,与同类试剂盒进行比较,并应用于其他病原体的检测。结果最佳核酸释放剂为:0.4 mol/L KOH,0.3%十二烷基硫酸锂(lithium lauryl sulphate,LLS),0.3%Triton X-100,0.02%Foam Ban和0.5%N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC);最佳PCR缓冲液组分如下:0.5 mol/L Tris-醋酸(p H 7.4),1%甘油,2.5%海藻糖,1 mol/L KCl,0.5 mol/L Mg Cl2,10 mmol/L EDTA、0.2%BSA和0.01%NaN3。建立的方法的最低检测量达1×10~2copies/ml,在1×10~2~1×10~9 copies/ml范围内参考品浓度与Ct值呈良好线性关系,回归方程为:y=-3.36 x+39.469 9,R2=0.999 9。该方法与同类试剂盒的检测结果差异无统计学意义(P0.05),不能用于检测解脲脲原体。结论酸碱"一步法"荧光PCR可用于HBV核酸的快速检测,该方法操作简便、快速,抗污染及干扰能力强,具有较高的临床应用价值。     

一种用于实时荧光PCR法检测肉制品中鼠源性成分特异性引物的研发

目的研发一种用于实时荧光PCR法检测肉制品中鼠源性成分的特异性引物。方法通过比对NCBI中多种物种的脱氧核糖核酸细胞色素b(mitochondrial deoxyribonucleic acid cytochrome b,Cytb)基因全序列,设计针对鼠源性成分的特异性引物。采用DNA提取试剂盒提取鼠DNA,以其为模板,通过设计的特异性引物进行实时荧光PCR扩增,试验重复3次。同时验证该引物的特异性,并对羊肉卷、牛肉卷和猪肉片样品进行检测。结果通过设计的特异性引物进行3次实时荧光PCR扩增的Cp平均值为16.47,标准差为0.430,熔解曲线具有明显的单一主峰,且重合度良好。仅鼠源DNA模板的PCR产物可见115 bp的目的条带,其他物种DNA模板均未扩增出该目的条带。羊肉卷、牛肉卷和猪肉片样品中均未检测出鼠源性成分。结论本实验设计的引物可用于实时荧光PCR法对肉制品中鼠源性成分的检测,且特异性较好。     

新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)最低检测限的确定

目的 确定上海捷诺生物科技有限公司研制生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)最低检测限,并验证其在最低检测限水平是否可有效检出新型冠状病毒.方法 将20份不同临床阳性样本稀释至62 500、12 500、2 500、500、100 copies/mL 5个浓度梯度,利用新型冠状病毒2019-...