小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体的分离及鉴定

目的 分离纯化小鼠原代腹腔巨噬细胞分泌的外泌体并进行鉴定。方法 分别经5只雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤,灌洗获得小鼠原代腹腔巨噬细胞后,用流式细胞术分析纯度。采用ExoQuick TC外泌体试剂盒提取小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体,BCA试剂盒测定外泌体蛋白含量,透射电镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径及分布,Western blot法检测外泌体标志物(CD9、CD63和TSG101)的表达。结果 每只小鼠可获得约5×10⁶个纯度为(99.17±0.65)%的腹腔巨噬细胞。5 mL小鼠原代腹腔巨噬细胞培养上清液中可提取869μg外泌体蛋白。小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体在电镜下呈折光性较强的典型茶托样囊泡,高表达外泌体特异性标志物TSG101、CD63和CD9,粒径分布集中在100～200 nm,平均粒径为175.2 nm。结论 腹腔注射巯基乙酸盐肉汤可提高小鼠原代腹腔巨噬细胞得率,ExoQuick TC外泌体试剂盒能够提取足量且纯度较高的小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体。     

脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞体外生长及细胞内固醇调节元件结合蛋白-1、肝脏X受体基因mRNA转录水平的时序性影响

目的分析脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)体外生长及细胞内固醇调节元件结合蛋白-1(sterol regulatory elementbinding protein 1,SREBP-1)和肝脏X受体(liver X receptor,LXR)基因mRNA转录水平的时序性影响。方法原代培养BMECs,用LPS(终浓度为10μg/m L)分别刺激BMECs 0、1、3、6、12、24和48 h后,显微镜下观察细胞状态,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法检测BMECs中SREBP-1及LXR基因mRNA的时序性表达水平。结果 LPS刺激BMECs 0、1、3 h后的生长状态良好,细胞形态饱满,胞浆丰富,无任何肉眼可见变化;LPS刺激6 h后,BMECs开始出现明显收缩、变圆,细胞间隙增大,细胞突起减少。与LPS刺激0 h比较,LPS刺激BMECs 1 h后可显著下调LXR基因mRNA转录水平(P0.05),刺激3 h后可显著下调SREBP-1基因mRNA转录水平(P0.05),且均随时间的延长呈逐渐降低趋势(P0.05),均于LPS刺激12 h时达最低,刺激24及48 h后LXR及SREBP-1基因mRNA转录水平均明显高于12 h,24和48 h间差异无统计学意义(P0.05)。结论 LPS可对BMECs产生严重损伤,能有效抑制BMECs中SREBP-1及LXR基因mRNA转录水平,且具有一定的时间依赖性。     

基于外泌体抗肿瘤药物递送系统的研究进展

肿瘤是全球相关疾病死亡的主要病因,尽管现有治疗方法已取得重大进展,但缺乏特异性,且生物利用度较低。外泌体是多泡体（multivesicular body,MVB）与质膜融合时释放介于30～150 nm范围内的脂质双层细胞外囊泡,是细胞间通讯的重要介质,可将蛋白质、脂质、核酸等细胞成分输送至邻近或较远的细胞,从而改变受体细胞的作用。外泌体作为天然纳米载体用于药物输送,可将装载的抗肿瘤药物输送至病灶部位,对各类肿瘤进行针对性治疗,且治疗效果较好。本文对基于外泌体抗肿瘤药物递送系统的优势、药物装载方法及不同细胞来源外泌体在肿瘤治疗中的研究进展作一综述,以期为肿瘤的针对性治疗提供依据。     

外泌体在白血病免疫调节中的作用

外泌体是活细胞分泌至胞外的一种微囊泡结构,携带有亲本细胞来源的核酸、蛋白质和脂质等生物大分子信息,是细胞间的通讯载体。外泌体与肿瘤细胞的免疫逃逸、增殖、迁移与血管生成等恶性生物学行为有关,促使白血病细胞对化疗药物产生耐药以及诱导T细胞凋亡。外泌体促进免疫系统激活,是一种潜在的白血病免疫治疗疫苗。另外,外泌体是发现白血病诊断和治疗生物标记物的一个窗口。本文就外泌体的生物学特性及其在白血病免疫调节中的作用作一综述。     

外泌体作为肿瘤诊断生物标志物的研究进展

胃癌、乳腺癌等癌症是导致人类死亡的主要原因之一,通常在晚期才被诊断出来,导致患者错过最佳治疗时机.为实现早发现、早治疗,提高肿瘤患者的治愈率,科研人员在肿瘤的早期诊断和预后评估等方面做了大量研究,发现了包括外泌体在内的多种诊断生物标志物.外泌体是一种由细胞释放的纳米囊泡,在血液、脑脊液等体液中广泛存在,肿瘤细胞释放的外...     

绿色荧光蛋白标记的BHK-21细胞源性外泌体的构建及鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和外泌体标志蛋白CD63的BHK-21细胞,获得GFP标记的BHK-21源性的外泌体。方法 将慢病毒表达质粒pCT-CD63-GFP与辅助质粒pVS-VG(Env)和pSPAX(structure)共转染293T细胞,包装重组慢病毒,测定病毒滴度后感染BHK-21细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达GFP的细胞。Western blot检测BHK-21细胞中CD63的表达量。取其无外泌体血清培养36 h的稳定转染株细胞上清,获得提取物,经Western blot、透射电镜及粒径分析进行鉴定。将提纯的外泌体与受体细胞BHK-21共培养6 h后,观察外泌体在细胞中的摄取情况。通过Transwell试验检测登革病毒（Dengue virus,DENV）感染后细胞外泌体分泌量的变化。结果 筛选出可稳定表达GFP的BHK-21细胞株,并从细胞上清中提取了外泌体。外泌体存在特异性标志蛋白CD63和CD81;透射电镜下,外泌体呈椭圆形,具有双凹圆盘状膜结构,直径在30～200 nm之间;纳米颗粒示踪分析显示...     

外泌体LncRNA在癌症诊断中的研究进展

癌症是世界上造成死亡最普遍的疾病之一,是一种早期无症状的疾病.癌症的发展分为几个过程,包括癌前病变-早期癌-癌症进展期.如果在癌症进展期发现,再进行治疗,患者存活率相对较低.近些年,外泌体越来越受到人们的关注.特别是外泌体作为多种疾病的生物标志物和多种癌症细胞间的通讯媒介,参与癌症的进展、转移、复发和侵袭越来越受到关注...     

外泌体miRNA提取方法的建立及优化

目的 建立及优化外泌体miRNA的提取方法,并与传统方法进行比较。方法 以MSC、NK、CIK细胞外泌体miRNA为研究对象,用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测gDNA去除柱对外泌体miRNA中基因组DNA的去除效果;并以浓度、纯度及基因表达水平（Ct值）为评价指标,优化提取方法中的裂解液（外泌体G2裂解液及外泌体miRNA裂解液）及聚集试剂（无水乙醇及异丙醇）。采用建立的方法、Trizol法及Trizol磁珠法提取MSC、NK、CIK细胞外泌体及健康人血清外泌体miRNA,进行实时荧光定量PCR检测。结果 gDNA去除柱可有效去除外泌体miRNA中的基因组DNA。外泌体miRNA裂解液提取MSC、NK、CIK细胞外泌体miRNA的浓度均显著高于外泌体G2裂解液（t=6.358,P=0.020）;外泌体G2裂解液提取的miRNA样品纯度均偏低,存在杂蛋白污染,而外泌体miRNA裂解液可有效去除污染;外泌体miRNA裂解液提取CIK细胞外泌体miRNA的miR-Let-7i、miR-16-1、miR-150基因Ct值明显低于外泌体G2裂解液（t=30.120,P=0.008）。异丙醇提...     

间充质干细胞来源外泌体修复炎症损伤的研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种具有自我更新和多向分化潜力的多能干细胞,能促进组织修复、再生和血管生成,还具有修复炎症损伤的潜力。MSCs来源外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-Exos）具有与MSCs相似的免疫调节和组织修复特性,并具有更高的安全性,可作为一种无细胞疗法替代MSCs治疗炎症损伤相关疾病。本文对MSC-Exos治疗炎症损伤的机制作一综述。     

脂多糖对奶牛乳腺成纤维细胞增殖速率、胞内Toll样受体及其信号通路相关基因mRNA表达水平的影响

目的探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对奶牛乳腺成纤维细胞(bovine mammary fibroblast,BMFB)增殖速率、胞内Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)及其信号通路相关基因m RNA表达水平的影响。方法原代培养BMFB,用LPS(终浓度10μg/mL)刺激BMFB不同时间后,经CCK-8法检测BMFB的增殖速率,实时荧光定量PCR法检测BMFB胞内TLR及其信号通路相关分子m RNA的表达水平。结果 LPS刺激BMFB 0、1、3 h后,BMFB增殖速率差异无统计学意义(P0.05),LPS刺激BMFB 6 h开始,试验组BMFB的增殖速率明显快于对照组(P0.05)。与对照组比较,LPS刺激BMFB 12 h后,TLR2、TLR4、信号转导通路激活核转录因子κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha-α,TNF-α)和白细胞介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor associated kinase 1,IRAK1)基因m RNA表达水平显著升高(P0.05),髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)基因m RNA的表达水平差异无统计学意义(P0.05)。结论 BMFB可能通过TLR2和TLR4识别LPS,并与NF-κB信号通路级联诱导炎性细胞因子和趋化因子的释放,参与奶牛乳腺先天性免疫应答。     

CHO-K1细胞培养上清及其外泌体的蛋白质组分析

目的:确定CHO-K1细胞能否够分泌外泌体,运用液相色谱-质谱联用技术鉴定无血清培养条件下CHO-K1细胞培养上清中的蛋白质和外泌体中蛋白质的成分.方法:将CHO-K1细胞驯化至无血清培养基中,采用exoRNeasy血清/血浆试剂盒提取培养基中的外泌体,透射电镜复染法鉴定其大小和形态,质谱法鉴定标志蛋白;提取培养上清和...     

辐射后A549细胞上清外泌体TMEM88蛋白表达与细胞周期的相关性

目的探讨辐射对肺腺癌A549细胞细胞周期的影响,观察其细胞上清外泌体TMEM88蛋白(transmembrane protein 88)的表达情况。方法取对数生长期肺腺癌A549细胞,按0、0.5、1、1.5、2 Gy剂量(剂量率1.75 Gy/min,300 Mu/min)照射细胞,培养6和12 h后,流式细胞术检测不同辐射剂量对细胞周期的影响;收集细胞上清,超速离心提取外泌体蛋白,Western blot法分析外泌体TMEM88蛋白的表达情况。结果 G2期细胞6 h检测结果显示,与0 Gy组相比,各剂量组细胞比例显著增加(P0.001),且随照射剂量增加,细胞比例增加越明显,除0.5 Gy组与1 Gy组外,其余各组间差异均有统计学意义(P0.001);12 h检测结果显示,G2期细胞比例随照射剂量增加而显著增加,各组间差异均有统计学意义(P0.05)。S期细胞6 h检测结果显示,与0 Gy组相比,0.5、1.0、1.5 Gy组S期细胞比例显著增加(P0.05);12 h检测结果显示,与0、0.5 Gy组相比,1.0、1.5 Gy组S期细胞比例显著增加(P0.05)。随照射剂量的增加,外泌体TMEM88蛋白的表达逐渐降低,6 h检测结果显示,0 Gy组与1.5、2.0 Gy组以及0.5 Gy组与2.0 Gy组相比,差异均有统计学意义(P0.05));12 h检测结果显示,0.5、1.0、1.5、2.0 Gy组与0 Gy组相比,差异均有统计学意义(P0.001)。结论辐射能够诱导肺腺癌A549细胞细胞周期阻滞,并能抑制细胞上清外泌体TMEM88蛋白的表达。     

X线辐射后肺腺癌A549细胞上清外泌体跨膜蛋白88表达与细胞增殖的相关性

目的探讨X线辐射对肺腺癌A549细胞增殖的影响,并观察其上清外泌体跨膜蛋白(transmembrane protein88,TMEM88)的表达情况。方法取对数生长期的肺腺癌A549细胞,分别用0、0.5、1、1.5、2 Gy(剂量率1.75 Gy/time,300 Mu/min)照射细胞,培养6和12 h后,CCK-8法检测不同辐射剂量对细胞增殖的影响;收集细胞上清,超速离心法提取外泌体蛋白,Western blot法分析外泌体TMEM88蛋白的表达情况。结果辐照后培养6 h,2 Gy组A450值明显小于0 Gy组及0.5 Gy组(P0.05);其他各剂量组与0 Gy组比较,A450值呈下降趋势,但差异无统计学意义(P0.05);辐照后培养12 h,与0 Gy组比较,各剂量A450值均降低,且呈剂量依赖性,除0.5 Gy组外,其他各剂量组差异均有统计学意义(P0.05)。辐射后培养6 h,随辐射剂量增加,TMEM88蛋白相对表达水平呈下降趋势,2 Gy组与0 Gy组比较,差异有统计学意义(P0.05);辐射后培养12 h,随辐射剂量增加,TMEM88蛋白相对表达水平呈逐渐下降趋势,且呈剂量依赖性,各组间差异均有统计学意义(P0.05)。结论 X线辐射可抑制肺腺癌A549细胞的增殖及细胞上清外泌体TMEM88蛋白的表达。     

藁本内酯对脂多糖诱导的肺上皮细胞损伤的保护作用及其机制

目的 探讨藁本内酯(ligustilide,LIG)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的肺上皮细胞损伤的保护作用及其机制.方法 将人肺上皮细胞BEAS-2B分为对照组、LPS组和LPS+LIG组,分别加入空白溶剂或对应药物培养,采用CCK-8法检测LIG对LPS诱导的BEAS-2B细胞增殖的...     

辐射后A549细胞上清外泌体磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表达与细胞增殖的相关性

目的观察辐射后肺腺癌A549细胞的增殖情况,探讨其与细胞上清外泌体中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表达的相关性。方法培养肺腺癌A549细胞,分别给予0、0.5、1.0、1.5、2.0 Gy剂量(剂量率1.75 Gy/time,300 Mu/min)辐射,辐射后培养6、12 h。采用CCK8法检测细胞增殖情况,收集细胞上清液,超速离心法提取外泌体,Western blot法检测外泌体膜蛋白GPC1的表达情况。结果辐射后A549细胞增殖能力减弱,与0 Gy组相比,各剂量组A450均减小,且随辐射剂量的增加,A450越来越小;各剂量组上清外泌体GPC1蛋白表达均减少(P0.001)。结论放疗可抑制A549细胞的增殖,且随辐射剂量增加抑制作用越明显;随着增殖受抑制,肺腺癌A549细胞上清外泌体中GPC1蛋白表达减少。     

基于细胞外囊泡疗法的非临床评价策略

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)这一概念在2011年由国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles,ISEV)提出,其可作为治疗药物以及药物的递送载体广泛应用于疾病治疗的各个领域。基于EV的疗法可能成为一种除传统药物治疗和细胞治疗之外的疾病治疗新模式——EV无细胞疗法。作为载体,相比于病毒载体和合成非病毒载体,EV具有独特的优势,潜力巨大。但EV由于其特有的生物学性质,在临床转化中具有一定困难。且该领域相对较新,尚无专门针对基于EV疗法的相关政策和法规出台。本文通过ClinicalTrials.gov平台采集信息,总结基于EV疗法的研究进展,针对现有的监管体系提出建议,并对EV非临床研究的一般原则、药学研究、药效学和药代动力学研究及安全性评价等非临床评价策略进行探讨,为制定基于EV疗法的非临床评价研究方案提供参考。     

分泌生长激素和催乳素的奶牛腺垂体细胞的分离鉴定及特征分析

目的获得具有生长激素(growth hormone,GH)和催乳素(prolactin,PRL)分泌功能的奶牛腺垂体细胞(dairy cow anterior pituitary cells,DCAPCs),并对其进行鉴定和特征分析。方法采用免疫组织化学方法对奶牛腺垂体中GH和PRL分泌细胞进行定位,利用酶消化法对其所在部位进行消化,获得的细胞经分离培养后,用形态学方法和免疫组织化学方法进行鉴定,并分析其传代性能;采用实时荧光定量PCR及ELISA方法对其GH和PRL合成和分泌特征进行分析。结果 GH分泌细胞主要位于腺垂体侧翼区下缘,而PRL分泌细胞主要位于腺垂体侧翼区上缘。获得的DCAPCs接种培养2 d后,可见形状规则的铺路石样上皮细胞,经免疫组织化学法鉴定,可分泌GH和PRL,经多次传代后仍可表达GH和PRL,但表达水平随代次增加而降低。结论成功建立了DCAPCs分离培养方法,可用于体外研究奶牛GH和PRL合成及分泌的调控机制。     

用于丙烯聚合的外给电子体及外给电子体复配的研究进展

综述了丙烯等规聚合Ziegler-Natta催化剂体系中外给电子体化合物的研究进展,重点是以二醚类为代表的新型外给电子体和外给电子体复配技术的特点、功能和作用机理。并在综合考虑给电子体的空间效应和电子效应以及内、外给电子体匹配的条件下,展望未来外给电子体化合物研究的发展动向。     

人气管上皮细胞的原代分离及气液界面培养

目的分离人气管上皮细胞,并进行气液界面(air-liquid interface,ALI)培养,为呼吸道病毒研究提供良好的细胞模型。方法采用低温消化法分离人气管上皮细胞,用预包被胶原的0.4μm Transwell培养皿对传代后的气管上皮细胞进行ALI培养。利用倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫细胞化学染色和免疫组化鉴定培养细胞的生长和分化情况,同时测定细胞分化过程中的跨上皮电阻(trans epithelial electrical resistance,TEER)。结果分离培养的气管上皮细胞光镜下细胞形态及免疫荧光角蛋白染色阳性,证实培养细胞为气管上皮细胞。ALI培养后的人气管上皮细胞的形态学、MUC5AC蛋白、Ⅳ型β-微管蛋白(β-tubulinⅣ)的表达及紧密连接和假复层的形成情况均与人气管组织结构类似。结论低温消化法可成功分离到活性高的上皮细胞。ALI培养的上皮细胞形态和功能与体内接近,且能较长时间维持其正常形态及功能,为呼吸道相关疾病的研究提供了理想的平台。