大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗生产工艺条件的优化

目的优化大菱鲆鳗弧菌VAM003株灭活疫苗的生产工艺条件。方法通过对大菱鲆鳗弧菌VAM003株培养基(TSB和LB)、培养基盐度(1. 5%、2. 0%、2. 5%、3. 0%、3. 5%NaCl)、接种量(5%、10%、15%)、发酵时间(6～12 h)进行筛选,采用最适发酵条件制备大菱鲆鳗弧菌VAM003株发酵菌液,分别加入不同终浓度的甲醛(0. 1%、0. 2%、0. 3%、0. 4%)灭活24、48、72 h,确定最适灭活条件。采用最适生产工艺制备2批大菱鲆鳗弧菌VAM003株灭活疫苗,并进行安全性及效力试验。结果大菱鲆鳗弧菌VAM003株最适发酵培养条件为:用含2. 5%NaCl的TSB培养基,在接种量10%条件下发酵培养10～12 h,活菌量达5×109 CFU/m L以上;最适灭活条件为:甲醛终浓度0. 2%灭活24 h。大菱鲆注射灭活疫苗后,全部健活,未出现临床症状,摄食、游姿及体色均正常,注射部位无红肿,内脏器官无病变;疫苗的免疫保护率达90%以上。结论成功优化了大菱鲆鳗弧菌VAM003株灭活疫苗规模化生产工艺条件,制备的灭活疫苗具有良好的安全性及效力,可用于大菱鲆鳗弧菌病的预防。     

弧菌福尔马林灭活条件的初步研究

目的 初步研究弧菌福尔马林灭活条件,为弧菌灭活疫苗的生产工艺提供参数。方法对弧菌培养菌液添加不同浓度的福尔马林,于不同温度下测定灭活时间;采用摇瓶和发酵罐培养弧菌,在28℃比较灭活效果,并检测弧菌灭活疫苗原液的安全性。结果福尔马林对弧菌的最低抑菌浓度为0.025%,不同浓度的福尔马林及不同温度所需的灭活时间不同,福尔马林浓度越大,灭活时间越短,加热能缩短灭活时间。摇瓶和罐灭活效果检测显示,在28℃,0.3%的福尔马林24 h可完全灭活,弧菌二联灭活疫苗原液的安全性符合要求。结论 0.3%福尔马林在28℃灭活24 h,是比较理想的弧菌灭活方法。     

副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008的原核表达及诱导条件的优化

为进一步确定致病性副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008的特异性结构和功能,采用PCR扩增出外膜蛋白VP1008的目的基因片段,构建重组表达质粒pET-28a(+)-VP1008,转化到大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达,实现重组外膜蛋白VP1008的高效表达,考察IPTG浓度、起始菌液浓度(OD600)、诱导温度、诱导时...     

鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因真核表达载体的构建及其在动物细胞中的表达

采用基因克隆方法,以带有突变的鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因的原核表达质粒pET24d(+)/m-empA7为模板,通过PCR扩增得到m-empA7基因,将其插入pCDNA3.1(+)构建重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/m-empA7;然后用磷酸钙法将其转染入动物细胞CHO和HEK293T中并进行瞬时表达,分别以RT-PCR和Western-blot检测重组质粒的基因转录和蛋白表达情况。结果表明,成功将突变的鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因转染至真核细胞中,并能够在动物细胞中正确地转录和表达,为鳗弧菌基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

优化微库仑法定硫的操作条件提高分析准确度

本文主要是对微库仑法测定石油产品中硫含量低于1ng／μ1的样品时,由于操作条件和人为因素的影响,较难得到准确的测定结果,针对产品分析中存在的实际问题,以TCS-200型微库仑仪测定加氢裂化装置重石脑油中的微量硫为例,分析讨论各种因素对测定转化率的影响及解决方法,从而优化操作条件．提高分析结果准确度。     

日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌的筛选及其发酵条件的优化

目的筛选二价日本血吸虫核酸疫苗质粒的适宜宿主菌,并对其发酵条件进行优化。方法通过综合考察细胞干重、质粒DNA产量及工程菌传代的质粒稳定性等参数,确定适宜宿主菌及其相适应的发酵培养基碳源、氮源和磷酸盐类型;进一步通过中心组合设计响应面试验,优化发酵培养基,并对优化的发酵培养基进行实验验证。结果确定适宜宿主菌为E.coliDH5α,优化的发酵培养基(m/v)为:NaCl1.0%,Yeast Extract1.0%,磷酸盐0.3%[其中m(K2HPO4)∶m(KH2PO4)=1∶4],甘油1.68%,牛肉汁2.28%,豆饼汁4.21%。在此发酵条件下,菌体干重由原来的1.57mg/ml增长至5.68mg/ml,质粒DNA产量由原来的3.94μg/ml增长至36.52μg/ml。结论已筛选出日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌,并优化了其发酵条件,明显提高了质粒DNA产量,具有大规模发酵生产应用价值。     

萘系高效减水剂磺化反应条件的优化

通过单因素试验,研究了萘系高效减水剂磺化反应所用原料工业萘、酸品种、酸度、磺化温度、磺化时间对产品性能的影响,得到了优化的磺化反应条件。     

高效自养型硝化细菌的分离及硝化条件优化

以焦化废水处理系统中的活性污泥为菌源,分离出具有较高硝化能力的自养型硝化细菌Z2。液体培养基中培养4天,菌株Z2的硝化效果可以达到100%。通过在不同温度、初始pH、摇床转速下研究其对菌株Z2硝化效果影响,得到该菌株的最优硝化条件为温度30℃,pH8.0,摇床转速250r/min。不同接种量的研究表明,增大接种量有利于硝化作用的进行。当底物亚硝酸盐氮浓度从101.51mg/L增加到507.55mg/L时,并未抑制该菌株硝化作用的进行。硝化过程中培养体系的pH逐渐增大,在理论上有利于硝化作用的进行。     

泽兰化学成分反相高效液相色谱分离条件的优化

优化了泽兰V(乙醇)∶V(水)=70∶30提取物的分离条件。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)考察了不同波长、酸抑制剂类型及其浓度、流动相梯度、进样量以及柱温对其分离效果的影响。确定其分离条件如下:Hypersil ODS2色谱柱(5μm,4.6 mm i.d.×250 mm);流速1.0 mL/m in;检测波长280 nm;流动相:(A)(甲酸)=0.75%的水溶液(以下简称为X%Y-水,其中X为数字,Y为水中的添加剂),(B)乙腈;梯度洗脱条件为:φ(B)=10%(5 m in)65 m inφ(B)=55%;进样量为20μL;柱温30℃。该方法获得的色谱图基线较平稳,分离度较高,能有效地对泽兰化学成分进行分析,可用于泽兰的质量控制。     

SPA的高效表达及其亲和介质制备条件的优化

使用M9培养基,以大肠杆菌BL21为宿主菌、pET32a（＋）为载体,在15℃、IPTG浓度为0.8 mmol.L-1、150 r.min-1、诱导时间为4 d的条件下,SPA能够得到高效表达;在SPA∶Sepharose 4B=1∶1（质量体积比）、偶联时间为14 h时,SPA偶联率为89.67%,对IgG的纯化效果最好。     

高转化效率甲基化酶缺陷大肠杆菌感受态细胞制备条件的优化

目的优化高转化效率甲基化酶缺陷的大肠杆菌DM1感受态细胞的制备条件。方法采用不同生长状态、转化冰浴时间、热激时间及转化后复苏时间的大肠杆菌DM1制备感受态细胞,分析转化效率。结果 A600值为0.39和0.69的菌液制备感受态细胞,转化冰浴时间为30min,42℃热激处理90s,大肠杆菌DM1的转化效率最高;转化后复苏时间对细菌转化效率的影响不明显。结论已优化了高转化效率甲基化酶缺陷的大肠杆菌DM1感受态细胞的制备条件,可满足大部分在质粒中进行的常规克隆的需要。     

转化法制备氯化铵的条件优化

以氯化钠和硫酸铵为原料,采用正交设计法对氯化铵的制备条件进行了优化。实验结果表明:在物料比为21,冰浴冷却时间为20 min,蒸发水量为45%,冷却温度为35℃的条件下,单次结晶氯化铵的产率和纯度明显提高。     

重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%~50%。补料前比生长速率为0.5~0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1~0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。     

N-氨甲酰基水解酶基因工程菌的发酵工艺优化

通过对基因工程菌发酵条件的研究,得知氯仿在0．02％的用量下可以通透细胞膜,使水解酶完全释放出来。最佳的发酵优化条件：接种龄为16-20h,接种量为2％,初始pH值为7．0,培养温度为30℃,葡萄糖为0．01％,甘油为0．30％,玉米浆为3％,NaCl为0．2％,KH2P04为0．05％,MgSO4为0．05％MnCl2为0．02％,CoCl2为0．01％。结果使DCase活力由原来的1．12u／IDL提高到2．1u／mL,提高了87．5％。     

微载体培养Marc145细胞实验条件的优化

目的优化Marc145细胞在微载体上的生长条件。方法对微载体培养Marc145细胞的细胞接种密度、微载体浓度和细胞培养基等培养过程中的关键工程参数进行优化。结果以微载体细胞密度4×104个/mg、微载体浓度7mg/ml在高糖DMEM(含30mmol/L葡萄糖,6mmol/L Gln)培养基中培养,48h后每12h换液50%的培养方式效果最为理想。结论优化的培养工艺适用于病毒疫苗的生产。     

均相烷基化法合成对异丙基苯胺条件的优化

以无水三氯化铝为催化剂,1,2-二氯乙烷为溶剂,通过Friedel-Crafts反应直接由氯代异丙烷和苯胺合成了对异丙基苯胺;用元素分析、FT-IR和1H NMR等方法表征了产物结构,正交实验方法优化了反应条件。结果表明,在反应温度为8℃、反应时间为60 min、无水三氯化铝对苯胺的摩尔比为1.3、氯代异丙烷对苯胺的摩尔比为1.5时,对异丙基苯胺对苯胺的收率可达70.9%。     

响应面法优化低组胺发酵香肠的工艺条件

目的 以组胺基因缺失植物乳杆菌配合啤酒酵母作为发酵剂,采用响应面法优化低组胺发酵香肠的工艺参数。方法对组胺基因缺失植物乳杆菌和啤酒酵母的菌种间比例、接种量、发酵温度和发酵时间4个因素分别进行单因素试验,根据单因素试验结果设计Box-Benhnken中心组合试验,以组胺含量为指标,采用响应面分析法确定最优发酵工艺参数。以优化的工艺制作发酵香肠,并测定各项质量指标。结果发酵香肠最优工艺参数为:组胺基因缺少植物乳杆菌与啤酒酵母菌种间比为7∶4,接种量0.71%,发酵温度30.84℃,发酵时间22.89 h,发酵香肠中组胺含量为3.94 mg/kg。以优化的工艺制作的发酵香肠各项质量指标均符合国家标准,组胺含量降低了54.5%。结论以优化的工艺制作的发酵香肠组胺含量降低,安全性得到提高。     

均匀设计法优化超声波辅助提取甘草总黄酮

目的:优化甘草中总黄酮的提取工艺。方法:在单因素实验基础上,采用均匀设计Ug*(85)表设计方法研究甲醇体积分数、料液比、超声时间对总黄酮提取率的影响,并使用Uniform Design 3.0软件建立甘草总黄酮提取的数学模型,并得最佳工艺条件。结果:甘草总黄酮提取的最佳工艺条件为:甲醇浓度为70%、超声时间为30 min/h、固液比为1∶20,甘草总黄酮的最大得率为3.69%。结论:用均匀设计Ug*(85)法得到的模型方程,可在设立的因素水平范围内给出甘草总黄酮得率极大值,进而探讨各因素对甘草总黄酮得率的影响机制。     

Optimization of Protoplast Isolation and Transformation for a Pilot Study of Genome Editing in Peanut by Targeting the Allergen Gene Ara h 2

The cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) is a legume consumed worldwide in the form of oil, nuts, peanut butter, and candy. Improving peanut production and nutrition will require new technologies to enable novel trait development. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9 (CRISPR–Cas9) is a powerful and versatile genome-editing tool for introducing genetic changes for studying gene expression and improving crops, including peanuts. An efficient in vivo transient CRISPR–Cas9- editing system using protoplasts as a testbed could be a versatile platform to optimize this technology. In this study, multiplex CRISPR–Cas9 genome editing was performed in peanut protoplasts to disrupt a major allergen gene with the help of an endogenous tRNA-processing system. In this process, we successfully optimized protoplast isolation and transformation with green fluorescent protein (GFP) plasmid, designed two sgRNAs for an allergen gene, Ara h 2, and tested their efficiency by in vitro digestion with Cas9. Finally, through deep-sequencing analysis, several edits were identified in our target gene after PEG-mediated transformation in protoplasts with a Cas9 and sgRNA-containing vector. These findings demonstrated that a polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation system can serve as a rapid and effective tool for transient expression assays and sgRNA validation in peanut.