赣榆县水产养殖环境抗生素耐药基因传播机制研究

为了解赣榆县水产养殖环境抗生素耐药基因的传播机制,对从该环境筛选得到的多重耐药细菌进行整合子—基因盒检测,并对底泥环境中微生物群落多样性进行调查。实验发现,在66株被检测的细菌中有42株携带Ⅰ型整合子,Ⅱ型整合子全部呈阴性。基因盒可变区片断PCR扩增,测序结果表明,甲氧苄啶类、氨基糖甙类耐药基因的形成与基因盒捕获有关。整合子—基因盒系统在多重耐药基因传播中起重要作用。16SrRNA克隆文库分析表明,养殖区底泥微生物群落多样性丰富,为抗性基因的传播提供了广泛宿主。     

副溶血弧菌分离菌株耐药性和毒力基因研究

本文研究了60株副溶血弧菌临床株和食品株的耐药表型、毒力基因以及基因分型.通过纸片扩散法测定其对18种抗生素的耐药情况,从中选取具有代表性的21株分离株,利用PCR方法进行毒力基因tdh和trh的检测,并对不同来源副溶血弧菌分离株进行MLST分型分析.结果 表明60株不同来源的副溶血弧菌分离株对氨苄西林、头孢唑啉、头孢...     

PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交检测鳗弧菌

以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)toxR基因内366~571 bp之间的基因序列为靶序列,采用PCR法制备对鳗弧菌特异性的地高辛标记DNA探针,探针长度为206 bp。选取2株鳗弧菌和8株与鳗弧菌亲缘关系非常接近的常见水产动物致病弧菌,通过斑点杂交法对制备的探针进行特异性检测,结果显示该探针对鳗弧菌杂交阳性,而与弧菌属的其它8株细菌均无交叉反应。这表明该地高辛标记探针具有很强的特异性,它能够很好地对鳗弧菌感染进行检测。     

迟缓爱德华氏菌等温扩增快速检测方法的建立

迟缓爱德华氏菌是一种危害淡水及海水水产动物的致病菌,可感染包括鳗鲡、牙鲆、罗非鱼、鲤鱼等在内的多种水产鱼类,极易给水产养殖业造成严重的经济损失.现有的迟缓爱德华氏菌检测方法须借助实验室条件才能完成,检测过程较为复杂.建立一种简便的、无需依赖实验室条件即可快速检测迟缓爱德华氏菌的方法,对水产养殖业预警和该病菌引发病害的防治具有重要指导意义和实用价值.针对迟缓爱德华氏菌的基因组设计了特异性引物和探针,建立了重组酶聚合酶扩增与侧向流试纸条(RPA-LFS)相结合的检测方法,评价了该方法的特异性和灵敏度,并使用人工模拟样本进行了方法验证.结果显示,RPA-LFS法在37℃孵育20 min即可完成核酸扩增步骤,整体检测时间不超过40 min,与参试的嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌这8种水产和食品中常见的致病菌不发生交叉反应,对迟缓爱德华氏菌培养物的检测限为单次反应1个菌落形成单位(CFU),在富集培养后,可检出1×101 CFU/g人工污染样本中的迟缓爱德华氏菌.该方法具有良好的特异性和灵敏度,不依赖精密仪器,是一种快速、便捷的迟缓爱德华氏菌检测方法,具有良好的应用前景.     

泥鳅病原菌Shewanella oneidensis P6的分离鉴定及防治药物筛选

为确定连云港灌南某泥鳅养殖场泥鳅病原菌的种类及耐药情况,从患病泥鳅的肠道、鳃、体表取样进行分离筛选和回归感染试验,确定编号为P6的菌株为致病菌株.通过对菌株P6进行形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析,将该致病菌株鉴定为奥奈达希瓦氏菌.应用9种市售渔药进行药敏试验,结果表明,杜菌康及健恒杆菌肠泰对菌株P6有较强的抑制作用,其最小抑菌浓度分别为6×10~(-3) g/L和5×10~(-3) g/L.4种中草药的药敏试验显示,黄连和大黄对菌株P6有抑制作用,其最小抑菌浓度分别为25g/L和100g/L.6种抗生素的药敏试验表明,菌株P6对头孢曲松钠、酒石酸吉他霉素、青霉素钠高度敏感,对硫酸庆大霉素、新氟康(氟苯尼考)中度敏感,对盐酸林可霉素低度敏感.     

纳米氧化铜与庆大霉素协同抗MRSA作用的研究

筛选具有协同抗耐药菌活性的纳米材料与抗生素组合是解决抗生素耐药问题的有效手段之一. 采用水热法合成粒径为20 nm的氧化铜纳米颗粒,通过抑菌圈法测定对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）具有明显耐药性的抗生素庆大霉素、环丙沙星、哌拉西林、头孢呋辛和头孢噻肟与纳米氧化铜的联合抗菌作用,筛选具有协同作用的纳米氧化铜-抗生素组合. 通过棋盘法测定纳米氧化铜-抗生素组合的部分抑菌浓度指数 （FIC）,并在此基础上测定两者对MRSA的时间-杀菌曲线. 实验结果表明纳米氧化铜与庆大霉素联用比两者单独使用的抑菌圈面积增大0.88倍,FIC值小于0.5,两者联用能够显著抑制细菌生长.     

几种常见细菌培养上清AI-2的检测及对大肠杆菌成膜影响

使用AI-2报告菌株哈氏弧菌BB170测定细菌培养上清AI-2的相对活性,同时使用结晶紫染色法定量分析大肠杆菌在外源细菌培养上清的作用下其生物被膜形成变化.结果显示,细菌培养上清能诱导哈氏弧菌BB170发出生物荧光,存在群体感应信号分子AI-2,可增强大肠杆菌生物被膜的形成,尤其是沙门氏菌和金黄色葡萄球菌培养上清的作用明显.当加入呋喃酮溶液,降低哈氏弧菌BB170荧光强度,抑制培养上清AI-2活性.     

对污水处理厂中大肠杆菌的四环素耐药性分析

抗生素的滥用导致了耐药菌的大量出现,对环境安全和人体健康造成潜在威胁.为研究污水处理厂进出水中的大肠杆菌对典型抗生素——四环素的耐药性和耐药基因的分布状况,以中国深圳市N污水处理厂和F污水处理厂的进水(NJ和FJ)和二沉池出水(NC和FC)为研究对象,从水样中分别分离培养得到86、88、46和52株大肠杆菌,比较菌株在有无添加10 mg/L四环素盐酸盐溶液的培养基中12 h的生长曲线,得到不同菌株对四环素的表观耐药性.结果表明,从污水处理厂进水样品NJ和FJ分离到的大肠杆菌对四环素耐药性检出率分别为36%和23%,出水样品NC和FC中的检出率分别为4%和8%,说明污水处理工艺对降低四环素耐药菌丰度有显著效果.采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和宏基因组学测序方法对部分敏感菌和耐药菌的四环素耐药基因进行检测,结果显示,四环素耐药菌中普遍携带tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(L)和tet(M)等四环素耐药基因,卡方检验(χ2检验)结果表明,四环素耐药基因与其耐药性密切相关.然而,在四环素敏感菌中也检测到四环素耐药基因tet(A),表明抗生素耐药性的表观型和基因型也可能存在不一致现象.该研究为进一步探究耐药菌的耐药机制和挖掘新型的耐药基因提供了实验基础.     

海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达

为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。该重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度抗生素G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,再经1%甲醇诱导表达,共筛选出4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,该酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,其目的蛋白表达量最高,并对革兰阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。     

鲢鱼、鳙鱼源鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定及系统发育分析

从金坛长荡湖网围养殖的鲢鱼、鳙鱼中分离到一株致病菌(160018-2),利用生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析进行细菌鉴定并进行药敏试验.结果表明,160018-2株为鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri),人工回感后病鱼出现体表出血、肠道充气、内脏出血等症状;药敏试验结果表明,该菌对恩诺沙星、盐酸环丙沙星、强力霉素、土霉素、氟苯尼考等5种药物敏感,对甲砜霉素、新霉素和红霉素耐药.