植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm的构建及验证

为拓宽pCAMBIA2300表达载体的使用范围,进一步方便植物基因工程科研工作者在构建表达载体时的需要,利用SacⅠ和XhoⅠ双酶切pJIT166载体获取"35S-GUS-CaMVterm"片段,将该片段插入到pCAMBIA2300表达载体的多克隆位点区,构建完成了pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm表达载体。所构建的表达载体通过农杆菌介导转化拟南芥,获得拟南芥转基因植株,转基因植株的GUS染色结果进一步验证了本文所构建表达载体的正确性和实用性。该表达载体的成功构建,方便了构建基因超表达载体,以及使得研究启动子的活性及GUS组织化学定位成为可能,还可以通过GUS染色对转基因植物进行鉴定,为植物基因工程科研工作提供了一个较好的备选植物表达载体。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式。方法设计引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc。通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7及c2c12细胞系,检测荧光素酶的表达情况。结果构建的pGL3-PGC-1α-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域(-2533⁺78)具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低。结论成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域(-2533+78)具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低。结论成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域(-2533⁺78)具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点。     

唐菖蒲GhMYC2基因启动子的活性分析

以唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种"Rose Supreme"为材料,采用hiTAIL-PCR方法克隆得到GhMYC2基因上游906bp的启动子序列。利用植物顺式作用元件查询数据库PLACE分析发现,GhMYC2启动子序列中不仅含有响应茉莉酸(jasmonate,JA)的元件T/GBOXATPIN2,还含有大量与病原菌诱发因子表达调节相关的转录因子WRKY以及抗性元件W-box、E-box等顺式作用元件。在ProGhMYC2::GUS转基因拟南芥中发现,GhMYC2的表达具有时空特异性,且主要在根、叶中表达。对转基因拟南芥进行茉莉酸甲酯(methyl jasmonic acid,MeJA)和灰霉菌(Botrytis cinerea)处理发现,转基因植株中GUS的表达均上调,表明其表达受到MeJA和灰霉菌的影响,此结果可为研究JAs途径调控植物抵御病害提供一定的参考。     

鹅CYP2C45基因核心启动子的鉴定及其多态性与产肝性能的关系

鉴定鹅CYP2C45基因核心启动子序列,并筛选其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,比较等位基因的转录活性差异及其与肝重性状的相关性,进而为肝重性状的选育筛选新的分子标记。通过双荧光素酶报告基因载体系统鉴定鹅CYP2C45基因启动子转录活性区域;通过PCR-SSCP、测序和序列比对方法分析朗德鹅的CYP2C45基因SNP,并分析不同基因型的转录活性;使用SPSS软件分析不同基因型与产肝性能的关系。结果表明通过双荧光素酶报告基因载体系统分析,发现鹅CYP2C45基因启动子活性区域为-165~+38bp;对朗德鹅群体进行了该区域SNP筛查,在5′上游-93bp处发现1个T/C突变,造成了屠体重的显著差异,对该突变造成的不同突变型进行转录活性分析,发现转录活性存在差异但未达到显著水平,推断CYP2C45基因的转录水平与鹅产肝性能呈正相关。本研究发现鹅CYP2C45基因核心启动子区域为-165~+38bp,该区域存在1个SNP,且与屠体重显著相关。     

牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。     

斑马鱼Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)质粒的构建及验证

为研究性腺体衍生因子基因(gsdf)在斑马鱼Danio rerio精巢发育过程中相关分子调控机制模型,提取了斑马鱼精巢总RNA,逆转录合成c DNA,并以其为模板,用RT-PCR法扩增得到gsdf基因,构建了以小鼠gamma-crystalin启动子启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp),采用显微注射技术注射该质粒至1细胞期的斑马鱼受精胚胎中。结果表明:在荧光显微镜下观察到19尾能在眼部晶状体中特异表达绿色荧光蛋白基因(gfp)的F0代斑马鱼,将表达了绿色荧光蛋白基因的斑马鱼同野生型(WT)非转基因斑马鱼杂交,最终获得能特异表达绿色荧光蛋白基因的F2代,且gsdf基因能在斑马鱼眼部晶状体中特异表达并稳定遗传。研究表明,在斑马鱼上建立的Tg (Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)转基因品系,为研究和观察斑马鱼精巢发育的分子调控机制提供了新的方法。     

STGC3基因启动子生物信息学分析及载体构建

目的运用生物信息学预测并分析鼻咽癌抑癌基因STGC3启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体。方法采用生物信息学软件预测STGC3基因5'端上游调控区5 000 bp序列进行启动子预测与分析,克隆最有可能的启动子,构建萤火虫荧光素酶双报告基因重组质粒,重组质粒经MluⅠ和BglⅡ限制性内切酶酶切及测序鉴定。结果 STGC3基因5'端上游-3 046 bp至-46 bp区域内有启动子活性,在-2 992 bp至-69 bp间启动子分值达0.8以上,其中-845 bp至-795 bp间分值最高,达到1.0。在-1 140 bp和-774 bp处检测到GC盒信号;在-441 bp处检测到CAAT盒信号。在-1 805 bp至-1 705 bp和-900 bp至-684 bp间各有一个Cp G岛;在-2 348 bp和-948 bp处各有一个转录起始位点。经不同长度的片段缺失比对,取最有可能的283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281 bp(-934 bp至-653 bp)和571 bp(-500 bp至+72 bp)启动子片段构建p GL3-en283、p GL3-en281及p GL3-en571三种质粒,质粒经酶切测序,酶切片段大小一致,序列正确。结论根据生物物信息学分析结果,成功构建STGC3基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为双荧光素酶报告基因检测系统研究该基因启动子活性提供前期基础。     

比较牛催乳素与生长激素对外源基因表达的影响

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供有价值的理论和技术基础。方法:将构建β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL乳腺特异表达载体分别转染体外培养的转基因小鼠乳腺上皮细胞;并将转染pcDNA3.1质粒和未转染细胞作为对照,收集不同代数的细胞及上清液,用RT-PCR及Elisa法分析mRNA及蛋白,分析比较二者对hTF表达水平的影响。结果:RT-PCR显示人转铁蛋白转录电泳条带明显;Elisa表明二者均能提高hTF蛋白水平的表达。结论:首次应用牛生长激素和催乳素对外源基因表达影响作用进行比较研究;β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL均能促进在乳腺上皮细胞水平上外源蛋白表达。因此,在研制转基因动物———乳腺生物反应器中,采用bGH和bPRL促进乳汁中外源蛋白特异、高效表达的载体都将是可选择的新技术途径。     

根癌农杆菌介导的金发草遗传转化条件的优化

金发草(Pogonatherum paniceum)是一种多年生岩生草本植物,在生态恢复和景观建设中起着重要的作用。利用根癌农杆菌介导转化金发草胚性愈伤组织,通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率研究菌液浓度、浸染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度、葡萄糖浓度、共培养时间等因素对金发草转化的影响,并利用确定的最佳条件将GUS基因转入金发草,获得稳定表达转化植株。结果表明:菌液浓度(OD600)为0.6,浸染时间为10min,添加20mg/L的乙酰丁香酮(AS)和10g/L的葡萄糖,共培养时间5d为最佳条件,GUS瞬时表达率最高。经过抗性筛选后最终获得阳性转基因植株频率为57%。再生植株经GUS染色和PCR检测证明,GUS基因已成功整合到金发草基因组中。此转化体系的建立为金发草的遗传改良及相关功能基因的研究奠定了基础。     

C-myc通过调控BubR1影响食管鳞癌细胞对紫杉醇的敏感性

探讨C-Myc与有丝分裂期检查点蛋白BubR1的表达关系和对紫杉醇药物作用的可能影响。用免疫组化方法检测23例食管鳞癌组织标本中C-Myc和BubR1的表达水平,并通过免疫印迹的方法比较3株食管鳞癌细胞株ECA-109,KYSE150和KYSE180中C-Myc和BubR1的表达高低,分析相关性;将人BUB1b基因启动子上游约2000bp片段插入pSEAP2分泌型碱性磷酸酶报告质粒中构建为pSEAP2-BubR1-P2000,分别转染至3株鳞癌细胞内,检测启动子激活效果;在ECA-109细胞内过表达C-Myc后再转染pSEAP2-BubR1-P2000后,检测启动子的激活效果;免疫印迹方法检测C-Myc抑制剂10058-F4对BubR1蛋白表达的影响;通过MTT检测10058-F4干扰C-Myc后ECA-109细胞在梯度紫杉醇浓度下的生存率变化;最后通过DAPI染色观察单用C-Myc抑制剂,单用低浓度紫杉醇(100nM)或联用10058-F4和紫杉醇组的凋亡比例。结果发现在临床食管鳞癌标本和食管鳞癌细胞株中C-Myc和BubR1的表达有相关一致性;C-Myc高表达的细胞株中BubR1启动子活性的激活程度更强,并且过表达C-Myc后能进一步上调启动子活性;C-Myc特异性抑制剂10058-F4可以有效下调BubR1表达,并减低细胞在梯度紫杉醇作用下的细胞生存率。DAPI染色结果显示联用10058-F4和低浓度紫杉醇能明显增加细胞处于有丝分裂期的比率。在食管鳞癌细胞中C-Myc能上调有丝分裂期检查点蛋白BuR1的水平,并与食管癌对紫杉醇的敏感性相关,C-Myc可能通过上调BubR1表达而减低食管鳞癌对紫杉醇的反应。     

丹波黑大豆醛脱氢酶基因GmALDH3-1的克隆、原核表达和功能分析

醛是一类具有高度反应活性的毒性物质,在生物体中主要由膜脂过氧化,氨基酸氧化和蛋白质的糖基化产生。醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)是一类以多种醛类为底物的酶类,醛脱氢酶基因是一类编码将醛脱氢氧化为相应羧基酸的基因,在植物,动物和微生物中均有发现。通过RT-PCR方法从丹波黑大豆根中扩增出基因GmALDH3-1。构建原核表达载体pGEX-4T-1-ALDH3-1,在E.coli BL21中表达,并研究不同浓度IPTG、时间和温度对ALDH3-1蛋白表达的影响,结果表明28℃下诱导6h ALDH蛋白表达量最大,而IPTG浓度对ALDH3-1的表达量影响不大。在添加有不同浓度Al、Cu和Cd的液体LB培养基中培养转化菌和对照菌,检测转化菌和对照菌的生长曲线,生长曲线实验结果表明ALDH3-1转化工程菌对上述金属离子具有一定的耐受性。这些结果为进一步研究其结构和生物学功能奠定了基础。     

胶质母细胞瘤中HOXD10基因启动子的甲基化检测及与预后的关系

目的 探讨同源异形盒基因D10(HOXD10)在胶质母细胞瘤中的启动子甲基化状态,并分析其基因启动子甲基化与患者预后的关系。方法 选取49例人脑胶质母细胞瘤和30例正常脑组织,采用甲基化特异性PCR技术检测HOXD10基因启动子甲基化状态,免疫组织化学法分别检测HOXD10蛋白表达,分析HOXD10基因启动子甲基化状态与患者临床病理特征的关系。Kaplan-Meier法分析HOXD10基因启动子甲基化状态与患者预后关系,Cox回归模型分析影响患者预后因素,Spearman相关性分析HOXD10基因启动子甲基化与其蛋白表达相关性。结果 与正常脑组织相比,胶质母细胞瘤HOXD10启动子甲基化阳性率升高(P<0.05)。HOXD10启动子甲基化状态与患者性别、年龄、KPS无关(P>0.05),肿瘤直径>5 cm患者的HOXD10启动子甲基化阳性率高于肿瘤直径≤5 cm患者(P<0.05),病理分级为高级别(Ⅲ～Ⅳ级)患者HOXD10启动子甲基化阳性率高于病理分级为低级别患者(P<0.05)。胶质母细胞瘤HOXD10启动子甲基化阳性患者PFS和OS均低于阴性患者PFS和OS(P<0.05)。病理分级和HOXD10基因启动子甲基化状态是影响患者预后的独立危险因素(P<0.05)。胶质母细胞瘤HOXD10基因启动子甲基化阳性患者HOXD10蛋白阳性率低于阴性患者(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,胶质母细胞瘤中HOXD10基因启动子甲基化与其蛋白表达呈负相关(r=-0.731,P<0.05)。结论 胶质母细胞瘤中HOXD10基因启动子甲基化阳性率升高,阳性表达患者预后较差,可作为患者预后评估的重要参考指标。     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

北方大豆栽培法

<正>大豆是中国主要的粮食和经济作物,作为油脂、蛋白质及保健活性物质的重要来源以及食品、饲料等多种加工工业的原料,发展潜力巨大。1选种选用抗病品种。应针对当地病害发生情况选用抗病品种。我省病毒病、霜霉病发生严重,所以应从各地实际出发,选择高产、优质、抗病品种。2种子处理2.1晒种:为提高种子发芽率和发芽势,播种前应将种子晒2-3天。晒种时应薄铺勤翻,防止中午强光曝晒,造成种皮破裂     

北方大豆高产栽培法

<正>大豆是中国主要的粮食和经济作物,作为油脂、蛋白质及保健活性物质的重要来源以及食品、饲料等多种加工工业的原料,发展潜力巨大。1、选种选用抗病品种。应针对当地病害发生情况选用抗病品种。我省病毒病、霜霉病发生严重,所以应从各地实际出发,选择高产、优质、抗病品种。2、种子处理2.1晒种:为提高种子发芽率和发芽势,播种前应将种子晒2-3天。晒种时应薄铺勤翻,防止中午强光曝晒,造成种皮破裂而导致病菌浸染。     

东北大豆高产栽培法

<正>大豆是中国主要的粮食和经济作物,作为油脂、蛋白质及保健活性物质的重要来源以及食品、饲料等多种加工工业的原料,发展潜力巨大。1、选种选用抗病品种。应针对当地病害发生情况选用抗病品种。我省病毒病、霜霉病发生严重,所以应从各地实际出发,选择高产、优质、抗病品种。2、种子处理2.1晒种:为提高种子发芽率和发芽势,播种前应将种子晒2-3天。晒种时应薄铺勤翻,防止中午强光曝晒,造成种皮破裂而导致病菌浸染。     

超声波、磁场和电场处理对大豆种子萌芽活力的影响研究

为了探究超声波、磁场和高压电场作用对大豆种子萌芽活性提高的效果,实验设置4组对照试验:超声波单独处理对照试验,磁场单独处理对照试验,电场单独处理对照试验,超声波、磁场和电场同时处理对照试验。通过大豆种子萌芽试验测试大豆种子的发芽率、发芽势、发芽指数以及发芽以后的豆芽长度和豆芽鲜重等参数。结果表明:经过超声波、磁场和电场单独处理能够有效的提高大豆种子的萌芽活力参数,而且3种物理方法对大豆种子萌发活力参数的提高程度没有明显差异,3种物理方法同时处理大豆种子也能明显提高大豆种子的萌芽活力参数,而且同时处理对大豆种子萌芽活力参数的提高程度要明显大于3种物理方法单独处理大豆种子的作用效果。     

结肠癌组织IL-10和IFN-γ mRNA的表达及其临床意义

目的:研究结肠癌组织白细胞介素-10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ)的基因表达及其相关的启动子区甲基化状态。方法:随机选取2011年1月-2014年6月80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常健康者结肠组织为对照组。采用亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR和实时荧光定量PCR检测对IL-10和IFN-γ基因的甲基化状况进行检测,分析其与结肠癌主要临床特征之间的关系。结果:三组组织的IL-10和IFN-γm RNA水平之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中结肠癌组和癌旁组组织的IL-10 m RNA均高于对照组(P<0.05),结肠癌组和癌旁组组织的IFN-γm RNA均低于对照组(P<0.05);三组IL-10基因启动子区-110,-185位点甲基化率比较,差异均有有统计学意义(P<0.05),其中结肠癌组和癌旁组组织的IL-10基因启动子区-110均高于对照组(P<0.05),结肠癌组组织的IL-10基因启动子区-185低于对照组(P<0.05);IFN-γ基因启动子区甲基化率结肠癌组>癌旁组>对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化状态影响其在结肠癌组织中的表达,结肠癌患者处于TH2极化状态,与结肠癌发生发展密切相关。     

人WDR79基因启动子表达载体的构建及鉴定

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和荧光素酶活性测定等实验手段,验证质粒pGL3-WDR79-promoter构建的正确性及其表达活性。本研究结果为进一步探讨人WDR79基因表达的调控机制奠定实验基础。     

过量表达酿酒酵母ZWF1基因对异丁醇产量的影响

以W303-1A为出发菌株,过量表达支链氨基酸转氨酶BAT2基因得到工程菌HZAL-2。通过过量表达编码乙酰乳酸合酶的ILV2基因、编码二羟异戊酸脱水酶的ILV3基因,得到工程菌HZAL-2pILV2pILV3。在工程菌HZAL-2pILV2pILV3的基础上进一步过表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的ZWF1基因,得到工程菌HZAL-2pILV2pILV3 22-ZWF1,其异丁醇产量比对照菌株提高6.81倍。结果表明,通过表达ZWF1基因提高NADPH产量可以解决菌体内部还原力不平衡的问题,从而提高异丁醇产量。