梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影的构建与鉴定

目的构建梅毒螺旋体(Tp)粘附素Tp0751的重组大肠埃希菌菌影(E.coli bacterial ghosts,EBG),为深入评价其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。方法将含有噬菌体Phi X174裂解基因E的质粒p HH43转化E.coli DH5α,42℃温控诱导使其形成EBG并计算裂解效率,用琼脂糖DNA电泳和透射电镜(TEM)鉴定EBG。构建含有裂解基因盒E-box、膜锚定序列E'-linker及Tp0751目的基因的原核双表达重组质粒p ET28a-E'-Tp0751-E-box,28℃诱导重组E.coli BL21表达Tp0751并用Western Blot鉴定;42℃诱导形成重组EBG(r EBG),计算裂解效率并用DNA电泳和TEM鉴定。结果构建的EBG裂解率为98.13%,DNA电泳未观察到DNA条带,TEM显示绝大部分细菌都裂解成缺乏胞浆成分的细胞空壳并保持活菌基本形态。r EBG在28℃时高效表达重组Tp0751蛋白,且仅与梅毒患者血清特异性结合;42℃下其r EBG裂解率为96.37%,电泳和TEM鉴定结果与EBG的相似。结论成功构建表达Tp粘附素Tp0751的r EGB,其所表达目的蛋白具有良好免疫反应性。     

重组蛋白TAT-NLS-Nkx6.2在大肠杆菌的表达纯化及活性测定

目的:构建重组基因TAT-NLS-Nkx6.2的原核表达载体,获得重组TN-Nkx6.2蛋白,并验证其生物学活性。方法:该实验先将人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子TAT、核定位信号NLS、Nkx6.2基因片段连接合成目的基因TAT-NLS-Nkx6.2。之后构建重组质粒pET-28a-TNNkx6.2并将其转化入E.coli DH5α中克隆,再转化至E.coli BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,经组氨酸Ni2+亲和层析纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE及Western blot鉴定融合蛋白,荧光免疫组化染色观察TN-Nkx6.2在小鼠脑组织分布。结果:成功表达并获得纯度90%以上的TN-Nkx6.2蛋白,经Western Blot鉴定,TN-Nkx6.2有良好的免疫原性和免疫反应性荧光免疫组化染色证明TNNkx6.2与小鼠大脑细胞结合并内化进入胞浆及胞核。结论:获得的融合蛋白TN-Nkx6.2具有生物学活性,并能穿过血脑屏障与小鼠大脑细胞结合,并内化进入胞核和胞浆,为深入探讨同源盒基因Nkx6.2在甲状腺减低模型的分子机制研究奠定了物质基础。     

5型和35型腺病毒纤毛蛋白的原核表达及活性验证

目的:原核表达5型腺病毒纤毛蛋白(Ad5 fiber)和35型腺病毒纤毛蛋白(Ad35 fiber),并对蛋白活性进行初步分析。方法:将重组质粒pET28a-Ad5 fiber和pET28a-Ad35 fiber转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经Ni-NTA凝胶珠亲和纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化蛋白,并用蛋白竞争性实验验证纯化蛋白的活性。结果:转化溶原菌后能够表达目的蛋白,Ad35 fiber蛋白对Ad5(5型腺病毒)感染无影响,只能阻断Ad5F35(5型腺病毒纤毛被替换为35型腺病毒纤毛的嵌合腺病毒)对细胞的感染;Ad5 fiber蛋白对嵌合腺病毒Ad5F35感染无影响,只能抑制Ad5对细胞的感染。结论:成功表达具有生物活性的5型和35型腺病毒纤毛蛋白,为进一步研究嵌合腺病毒Ad5F35感染细胞的机制奠定基础。     

GRIM-19表达对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:通过体内和体外实验探讨GRIM-19表达对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法:采用脂质体转染法将GRIM-19重组质粒转染HeLa细胞,建立稳定表达GRIM-19的细胞株;采用RT-PCR和Western印迹法检测HeLa细胞转染GRIM19重组质粒前后GRIM-19 mRNA和蛋白水平的表达情况;应用MTT法检测各组细胞增殖水平,并将HeLa/con、HeLa/GRIM-19细胞接种到裸鼠皮下以检测荷瘤情况;同时对移植瘤检测其GRIM-19 mRNA及其下游STAT3 mRNA的表达水平.结果:建立稳定表达GRIM-19基因的HeLa/GRIM-19细胞株.RT-PCR结果显示GRIM-19基因在HeLa/GRIM-19细胞中mRHA表达明显增加,Western 印迹法检测同样发现GRIM-19蛋白的表达显著升高,而STAT3的表达明显受到抑制.MTT检测结果显示HeLa/ GRIM-19细胞增殖较HeLa/con明显减慢(P<0.05),其接种后肿瘤生长速度亦明显减慢(P<0.01).移植瘤的RT-PCR结果表明GRIM-19表达升高、STAT3表达降低.结论:GRIM-19的表达可以抑制子宫颈癌细胞的增殖,可能作为子宫颈癌治疗的一个新靶点.     

葛根素抑制人子宫颈癌细胞株HeLa增殖和诱导凋亡作用研究

目的:探讨葛根素对人子宫颈癌细胞株HeLa的作用及其机制。方法:取对数生长期的HeLa细胞分别用不同剂量的葛根素处理(0μmol,12.5μmol,25μmol,50μmol)。细胞培养48 h后,利用MTT法检测HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡水平,RT-PCR法检测Bax mRNA和Bcl-2 mRNA水平。Western blotting法检测Wnt、β-catenin、Bax、Bcl-2、p53和p21表达水平。结果:葛根素成剂量依赖性地抑制HeLa细胞增殖,促进细胞凋亡,促进BaxmRNA表达,减少Wnt、β-catenin、Bcl-2 mRNA、p53和p21表达。结论:葛根素可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制与减少Wnt/β-catenin信号通路活化相关。     

ARHI基因与HuR蛋白在胰腺癌PANC-1细胞中的表达

目的观察ARHI基因转染胰腺癌PANC-1细胞后对HuR蛋白的影响。方法采用脂质体法将表达ARHI基因的质粒p LNCX2-ARHI-EGFP和空载体p LNCX2-EGFP转染胰腺癌PANC-1细胞,细胞分为3组:实验组(p LNCX2-ARHIEGFP)、空载体转染组(p LNCX2-EGFP)和PANC-1细胞空白对照组,用G418筛选稳定转染的细胞株;采用PCR和Western blot方法检测ARHI基因表达,采用Western blot方法检测HuR蛋白表达。结果稳定转染ARHI基因组可检测到ARHI基因mRNA和蛋白的表达。根据图像灰度计算蛋白条带相对表达量,稳定转染ARHI基因组HuR蛋白表达(0.2226±0.0644)较空载体对照转染组(0.4063±0.0925,P=0.029)和PANC-1细胞空白对照组(0.4178±0.1319,P=0.022)显著降低。结论 ARHI基因可以导致胰腺癌细胞株中HuR蛋白表达降低。     

PEITC通过抑制结肠癌细胞PI3K/NF-κB活性而抑制MMP-9表达

目的观察异硫氰酸苯乙酯(PEITC)对结肠癌细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响及其分子机制。方法体外培养结肠癌细胞系SW480,分别用10、30、50μmol/L PEITC作用24 h,划痕愈合实验和侵袭实验分别检测PEITC对SW480细胞迁移与侵袭的影响。RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达;Western blot检测MMP-9蛋白表达和蛋白激酶B(Akt)磷酸化。荧光素酶报告基因分析核转录因子κB(NF-κB)和MMP-9的活性。结果划痕愈合实验和Transwell小室实验结果显示,PEITC能在不影响细胞活性的条件下对SW480细胞侵袭和迁移具有一定抑制作用。同时,Western blot和RT-PCR结果证实PEITC能抑制MMP-9蛋白及mRNA表达。PEITC能抑制Akt磷酸化以及NF-κB的转录活性。PI3K抑制剂LY294002处理后,NF-κB-luc活性以及MMP-9蛋白表达显著降低。此外,不同浓度PEITC处理能显著抑制MMP-9的启动子活性。结论 PEITC是一种潜在的抗结肠癌细胞转移药物,它可能通过影响PI3K/NF-κB通路抑制MMP-9表达而发挥作用。     

pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA3.1/mIFN-γ重组质粒构建及表达

目的构建日本血吸虫动力蛋白轻链DNA疫苗和小鼠干扰素真核表达质粒,研究其在HeLa细胞及动物体内的表达。方法设计特异性引物,PCR扩增获取动力蛋白轻链(SjDLC)与干扰素-γ(IFN-γ)基因,克隆于pcDNA3.1真核质粒,经双酶切及测序鉴定。将两种重组质粒分别转染至HeLa细胞,Western blot鉴定其表达。真核质粒经左腿股四头肌免疫小鼠,在末次免疫2周后,PCR法检测小鼠肌组织内SjDLC和IFN-γ基因,免疫组织化学法检测基因的表达,MTT法检测T细胞增殖水平。结果 PCR和双酶切能检测到280 bp的SjDLC基因及480 bp的IFN-γ基因;Western blot显示在12 kDa和19 kDa处有阳性反应条带,与SjDLC和IFN-γ分子量大小一致,两种基因能在HeLa细胞中表达。PCR及免疫组化显示两种基因能在小鼠肌肉组织中存在和表达。MTT法显示两种质粒均能刺激T细胞增殖。结论成功构建pcDNA3.1/SjDLC和pcDNA 3.1/mIFN-γ真核质粒,两种质粒能在HeLa细胞和动物体内表达。     

linc00152通过调控DNMT3A和DNMT3B促进人宫颈癌细胞生长与侵袭

探讨linc00152在宫颈癌中的生物学功能及其调控机制。运用qRT-PCR检测人宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞中linc00152的表达;转染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B于HeLa细胞以敲低细胞中linc00152、DNMT3A和DNMT3B的表达水平,采用qRT-PCR与Western blot法检测转染效率;采用Western blot法检测sh-linc00152对甲基化转移酶(DNMT)3A和3B蛋白表达水平的影响;采用MTT、Transwell侵袭实验检测sh-linc00152、si-DNMT3A以及si-DNMT3B对人宫颈癌HeLa细胞增殖与侵袭的影响。结果显示,linc00152在宫颈癌细胞中的表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞(P<0.01);在HeLa细胞中,sh-linc00152组DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平明显低于sh-control组;sh-linc00152组、si-DNMT3A以及si-DNMT3B组HeLa细胞的存活率及穿过基质胶的HeLa细胞数量均明显低于各自对照组。linc00152可能通过调控DNMT3A和DNMT3B信号通路促进人宫颈癌细胞生长与侵袭。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。