斑马鱼ISL1蛋白多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究ISL1作为第二生心区心脏前体细胞的分子标志在心脏发育中的功能,需要获得ISL1蛋白并制备其抗体。方法根据已报道的ISL1基因序列,以斑马鱼mRNA为模板进行PCR扩增得到ISL1部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。将重组质粒进行酶切测序鉴定,然后利用大肠杆菌E.coli BL21对该重组质粒进行表达。经过IPTG诱导,采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的his-ISL1融合蛋白免疫新西兰大白兔制备ISL1多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价。结果获得了ISL1原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗ISL1多克隆抗体。结论本实验为ISL1在斑马鱼心脏发育中的新功能的进一步研究奠定了基础。     

布鲁菌Omp31蛋白的多克隆抗体制备与质量检测

本文以布鲁菌omp31基因作为研究对象,对重组蛋白的免疫原性进行了研究。结果显示:重组Omp31蛋白可以刺激家兔产生抗体,而且,抗体质量较好。     

耻垢分枝杆菌MurB蛋白的可溶性表达、纯化和多克隆抗血清制备

获得耻垢分枝杆菌MurB纯化蛋白,制备小鼠源性MurB多克隆抗血清。首先,利用PCR技术扩增耻垢分枝杆菌murB基因,连接至pColdII载体并转化至E.coli BL21(DE3)菌株;然后,低温下以IPTG诱导MurB蛋白的表达,并利用Ni-His亲和层析技术纯化MurB蛋白;最后,将MurB纯化蛋白联合免疫佐剂注射BalB/c小鼠,经过初次免疫和2次加强免疫后分离抗血清,并分别利用ELISA和Western blot技术检测制备的抗血清对MurB蛋白的效价和特异性。结果显示:已获得具有理想浓度和纯度的MurB纯化蛋白;已制备具有较高效价的小鼠源性MurB多克隆抗血清,该抗血清能够特异性识别耻垢分枝杆菌可溶性蛋白组分中的MurB蛋白。因此,制备的MurB多克隆抗血清能够应用于分枝杆菌MurB蛋白的检测分析,为MurB功能研究奠定了基础。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

粉尘螨第十六类变应原的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 获得大量具有良好IgE结合活性的粉尘螨第十六类变应原（Der f16）的重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究.方法 挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知Der f16基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Der f16基因片段,产物连入pMD32-T载体中.扩增后,利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切将目的 基因片段连接到pET32a表达载体上,转化到大肠杆菌（E.coli BL21）中经IPTG诱导表达.表达载体经亲和层析纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度,Western bolt检测变应原免疫学活性.结果 以粉尘螨总RNA为模板成功克隆出Der f16基因,与数据库中Der f16基因同源性为100%;经IPTG诱导后,大肠杆菌大量表达Der f16蛋白,所获得的重组蛋白分子质量为73 ku,上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物.重组Der f16能够与螨过敏患者血清中的IgE 反应,而不与健康者血清中的IgE反应.结论成功构建了Der f16的原核表达载体,并高效表达和纯化出具有免疫原性的Der f16重组蛋白.     

L-谷氨酸氧化酶的克隆表达、纯化及酶学性质研究

为提高微生物产L-谷氨酸氧化酶水平,将Streptomyces sp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因(LGOX)与表达载体pET28a连接,导入E.coli BL21(DE3),实现LGOX的高效表达。采用HisTrapTMFF亲和层析柱对重组L-谷氨酸氧化酶进行纯化,并对纯酶的酶学性质进行了研究。结果表明:在IPTG终浓度为0.4 mmol/L下,30℃诱导6 h,可以获得比酶活为1.1 U/mg的粗酶液;重组酶的最适反应温度和pH分别为37℃和5.0;Km值为2.12 mmol/L,Vmax为1.06μmol/min.mg,对L-谷氨酸具有专一性;具有良好的应用前景。     

E.coliRecQ解旋酶克隆表达纯化及生物学活性检测

RecQ解旋酶是生物分子代谢过程中重要的大分子物质,对保持遗传物质的稳定性具有重要作用。通过PCR从E.coli DH5α菌株的基因组中扩增出E.coli RecQ基因并克隆入原核表达载体pET24a(+)中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中。优化表达条件后,经镍柱螯合亲和层析纯化获得纯度大于90%的目标蛋白质,应用生物化学和生物物理学技术研究E.coli RecQ解旋酶的生物学活性。结果表明,E.coli RecQ解旋酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。在等蛋白质浓度下,E.coli RecQ酶结合DNA活性强弱依次为开叉dsDNA,ssDNA,平末端dsDNA。其还具有ATP依赖的dsDNA解链活性和时间依赖的DNA退火活性。实验为RecQ解旋酶家族其他重要成员的活性功能研究提供了理论依据和重要参考。     

VEGFⅡ/GRP融合蛋白的构建、表达、纯化及其抗小鼠RM-1前列腺癌的作用研究

设计并构建一种含VEGF和GRP抗原表位的表达载体p ET28a-VEGFI-M2-GRP质粒,将其转化至大肠杆菌中,并对重组菌进行乳糖诱导表达,超声破碎,包涵体经洗涤、溶解、透析复性、离子交换层析等方法进行分离纯化后得到目的蛋白VEGFⅡ/GRP,Western blot鉴定。建立前列腺癌RM-1细胞的C57BL/6J小鼠皮下移植瘤模型,以VEGFⅡ/GRP作为疫苗进行免疫。观察荷瘤小鼠的肿瘤生长情况计算抑瘤率,比较各组血管生成数以及ELISA检测抗VEGF抗体浓度,并研究该蛋白疫苗的抗肿瘤生长作用和抗血管生成作用。结果显示:ELISA结果表明小鼠血清中抗VEGF抗体比NS组高(P<0.05),重组蛋白VG组与NS组相比抗血管作用显著(P<0.05)。初步显示构建的重组蛋白有抑制肿瘤血管生长的作用。     

重组人LIF融合蛋白表达纯化及其活性鉴定

目的:原核表达重组hLIF融合蛋白并进行诱导表达、纯化及活性鉴定。方法:将hLIF基因克隆至pThioHisA载体,构建融合表达载体pThioHisA-hLIF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析后,Western blot检测目的蛋白的特异性。用小鼠胚胎干细胞脱饲养层培养对纯化后的重组hLIF融合蛋白进行生物活性的鉴定。结果:降低诱导温度和延长诱导时间能增加hLIF融合蛋白的可溶性表达,纯化后的重组蛋白纯度大于95%,Western blot检测显示了良好的特异性。在脱饲养层细胞培养条件下,添加纯化的hLIF融合蛋白能够有效的维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态。结论:重组hLIF融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,具有良好的特异性,为干细胞研究及hLIF蛋白的其他功能研究奠定了基础。     

建立扩大消费需求长效机制的流通业再造

建立扩大消费需求长效机制是中央提出的扩大内需的重要举措,而流通业作为消费的平台和窗口,直接影响着消费的规模和速度,对加快建立扩大消费需求长效机制起着举足轻重的作用,是实现消费的桥梁。根据建立扩大消费需求长效机制的要求,针对我国流通业存在的短期行为及其快速发展背后隐藏的问题,必须对流通业进行再造和创新。一要改善流通环境,建立商业诚信体系,提供放心商品和优质服务,这是流通业促进建立扩大消费需求长效机制的重中之重;二要完善农村商品流通体系,这是建立扩大消费需求长效机制的基础;三要加强流通规划工作,这是促进建立扩大消费需求长效机制的战略措施;四要加快流通基础设施建设,这是促进建立消费需求长效机制的物质保证;五要创新商业业态,这是流通业促进建立扩大消费需求长效机制的推动力;六要建立绿色商业、循环消费的流通体系,这是建立扩大消费需求长效机制的内在要求;七要推动电子商务发展,创新网上购物,这是流通业促进建立扩大消费需求长效机制的亮点;八要完善高端品牌流通渠道,满足高端品牌消费需求,这是促进建立扩大消费需求长效机制不可或缺的方面。     

抑郁障碍患者脑功能磁共振研究

目的:应用低频振幅(ALFF)分析方法研究首次发病为抑郁障碍的患者脑功能的异常,探讨首发抑郁障碍发病的脑机制。方法:对2011年11月-2013年10月在山西医科大学第一医院收集的13例首发抑郁障碍患者进行脑功能磁共振扫描,另选取14例年龄、性别、受教育年相匹配的正常对照组进行脑功能磁共振扫描,采用汉密尔顿抑郁评分变化测定临床反应。结果:抑郁组与正常对照组比较研究发现右侧中央旁回ALFF值明显大于正常对照组(P<0.05);右侧的岛叶、海马、尾状体的ALFF值明显低于正常对照组(P<0.05)。结论:抑郁障碍患者与正常对照组相比存在静息态脑功能的异常。     

重组蛋白TAT-NLS-Nkx6.2在大肠杆菌的表达纯化及活性测定

目的:构建重组基因TAT-NLS-Nkx6.2的原核表达载体,获得重组TN-Nkx6.2蛋白,并验证其生物学活性。方法:该实验先将人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子TAT、核定位信号NLS、Nkx6.2基因片段连接合成目的基因TAT-NLS-Nkx6.2。之后构建重组质粒pET-28a-TNNkx6.2并将其转化入E.coli DH5α中克隆,再转化至E.coli BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,经组氨酸Ni2+亲和层析纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE及Western blot鉴定融合蛋白,荧光免疫组化染色观察TN-Nkx6.2在小鼠脑组织分布。结果:成功表达并获得纯度90%以上的TN-Nkx6.2蛋白,经Western Blot鉴定,TN-Nkx6.2有良好的免疫原性和免疫反应性荧光免疫组化染色证明TNNkx6.2与小鼠大脑细胞结合并内化进入胞浆及胞核。结论:获得的融合蛋白TN-Nkx6.2具有生物学活性,并能穿过血脑屏障与小鼠大脑细胞结合,并内化进入胞核和胞浆,为深入探讨同源盒基因Nkx6.2在甲状腺减低模型的分子机制研究奠定了物质基础。     

基于PSO-SVM模型的短期电力负荷预测研究

文章分析了影响电力负荷的因素,对现存的短期电力负荷预测方法进行了研究,采用粒子群算法对支持向量机进行参数寻优,建立了基于粒子群优化的预测模型,并对短期电力负荷进行预测仿真,为精准且快速地预测短期电力负荷提供了有效的方法。通过实例分析验证了该模型在电力负荷中的预测精度,结果显示其精度值较高。     

安非他酮缓释片与帕罗西汀片治疗惊恐障碍的疗效观察

目的:对照观察安非他酮缓释片与帕罗西汀片治疗惊恐障碍患者的效果和安全性。方法:将82例惊恐障碍患者随机分为研究组和对照组,各41例。研究组采用安非他酮缓释片治疗,对照组使用帕罗西汀片,疗程均为6周。采用惊恐障碍相关症状量表(PASS)、汉密尔顿抑郁量表(HAMD)和汉密尔顿焦虑量表(HAMA)评定疗效,治疗前后分别对患者行心电图、肝功能、肾功能等检查以评价安全性。结果:治疗第1、2、4、6周末,两组的PASS、HAMD及HAMA评分均低于治疗前,差异均有统计学意义(P<0.05);研究组治疗第1、2、4、6周末的PASS、HAMD及HAMA评分与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗6周末,研究组的总有效率为80.0%,对照组为77.5%,两组的总有效率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。研究组出现性功能障碍、情感高涨、情绪易激惹、心电图异常的例数均多于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:安非他酮缓释片治疗惊恐障碍与帕罗西汀效果相当,且起效较快、药物不良反应轻,值得推广应用。     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。     

河南省城区老年人对公共体育服务需求的研究

运用文献研究、问卷调查和数理统计等方法,对河南省城区老年人体育锻炼情况及对体育公共服务需求的满意度进行了分析,得出老年人对健身活动开展需求、健身组织需求和健身信息需求的满意度相对较高,对场地设施需求、健身指导需求的满意度相对较低,对体质监测需求几乎不存在满意度。依据结果提出要进一步提高政府对老年人体育公共服务的重视程度,建立老年人体育公共服务供需的协同机制,加强老年人体育组织建设,建立需求导向型老年人体育公共服务需求供给制度和建立老年人体育公共服务问责和风险分配机制等对策。     

HβD-3在大肠杆菌中的融合表达与纯化

抗菌肽是生物体内合成的一种具有抗菌活性的多肽类物质,对多种病原体乃至耐药性菌株具有明显的杀伤作用,是固有免疫及适应性免疫的重要参与物质。HβD-3是人体内一类内源性多肽,与其它β-防御素相比,耐高盐,具有灭活多种耐药性菌株的能力。针对如何高效表达和快速纯化这个问题,研究选用pET-EI质粒载体在E.coli BLR(DE3)表达原始序列HβD-3及密码子优化序列HβD-3i。经密码子改造后的重组抗菌肽HβD-3i的表达量是原始序列HβD-3表达量的约12倍之多。对融合表达产物进行"ITC法"纯化蛋白,纯化后的HβD-3i具有与天然HβD-3相似的生物学活性,对金黄色葡萄球菌的活性强于伤寒沙门菌。表明利用pET-EI原核表达系统表达HβD-3是可行的,且因该纯化方法经济简便,为实现HβD-3大规模生产奠定基础。