植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm的构建及验证

为拓宽pCAMBIA2300表达载体的使用范围,进一步方便植物基因工程科研工作者在构建表达载体时的需要,利用SacⅠ和XhoⅠ双酶切pJIT166载体获取"35S-GUS-CaMVterm"片段,将该片段插入到pCAMBIA2300表达载体的多克隆位点区,构建完成了pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm表达载体。所构建的表达载体通过农杆菌介导转化拟南芥,获得拟南芥转基因植株,转基因植株的GUS染色结果进一步验证了本文所构建表达载体的正确性和实用性。该表达载体的成功构建,方便了构建基因超表达载体,以及使得研究启动子的活性及GUS组织化学定位成为可能,还可以通过GUS染色对转基因植物进行鉴定,为植物基因工程科研工作提供了一个较好的备选植物表达载体。     

过表达水稻MYB转录因子OsARM1对转基因拟南芥冷冻耐受性的提高

克隆水稻MYB转录因子OsARM1全长编码序列(coding sequence,CDS)并构建植物过表达载体,转化获得过表达OsARM1的拟南芥。冷冻处理结果显示,OsARM1能明显提高转基因拟南芥的冷冻耐受性,与野生型对照处理后存活率只有37.04%相比,转基因过表达OsARM1的拟南芥存活率达到83.33%与86.11%。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)分析结果表明,在低温处理下OsARM1主要通过影响低温响应相关基因CBF和下游COR基因的表达水平来提高转基因拟南芥的冷冻耐受性。同时,GUS染色结果显示,OsARM1只在转基因拟南芥的叶柄和叶片输导系统中特异性表达,推测其可能通过参与脯氨酸和可溶性糖等的转运和分布来提高植物的冷冻耐受性。     

甜菜BvBHLH92基因组织表达及亚细胞定位研究

BHLH蛋白家族是一类含有BHLH结构域,并广泛存在于植物中的一类重要转录因子。前期从甜菜中克隆得到了甜菜BvBHLH92基因,本研究对BvBHLH92基因的蛋白序列、组织表达及亚细胞定位进行分析。研究发现甜菜BvBHLH92蛋白包含225个氨基酸,并具有BHLH转录因子基因家族的典型功能结构域。同时,系统发育分析发现BvBHLH92蛋白与甜菜BvBHLH93及拟南芥At BHLH92亲缘关系较近。组织特异性表达检测表明BvBHLH92基因在甜菜花中表达量最高,而在根部位表达量最低,进一步研究发现BvBHLH92基因在甜菜根和叶部位响应盐胁迫诱导表达。此外,亚细胞定位分析证明BvBHLH92蛋白定位在细胞核,推测BvBHLH92蛋白在细胞核中调控相关基因的表达,进而调节甜菜对盐胁迫的响应变化。     

番茄SlWDR141基因的克隆及功能研究

为研究番茄WD40蛋白基因(SlWDR141)的功能,对SlWDR141蛋白进行生物信息学分析,发现SlWDR141蛋白在进化过程中高度保守,与土豆的同源性最高。在克隆SlWDR141基因全长序列的基础上,构建了亚细胞定位和酵母双杂交表达载体,证实SlWDR141蛋白主要定位在细胞核中,与DDB1具有相互作用。实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析SlWDR141基因在组织中的表达谱,发现它在各个组织中均有表达,但在根中的表达量最高。为研究该基因的生物学功能,进一步构建了SlWDR141基因的干涉载体,用农杆菌介导法转化番茄得到转基因阳性番茄,荧光定量PCR鉴定出3个表达量下调的独立转基因株系。NaCl胁迫和Pst DC3000侵染野生型和转基因植株发现,转基因植株相对于野生型植株抗盐性和抗病性均下降,表明SlWDR141基因对盐胁迫和细菌侵染均起正调控作用。     

转香蕉MaASR1基因的拟南芥株系在干旱胁迫条件下的表达谱分析

干旱是最重要的环境胁迫,香蕉MaASR1基因在植物响应逆境胁迫时发挥着重要作用,为了深入研究MaASR1基因的过表达使拟南芥抗旱的分子机制,利用全基因组表达芯片来广谱的筛选MaASR1基因转入后自然条件下及干旱处理条件下差异基因的表达情况。对基因芯片的结果进行了详细的生物信息学分析及相关基因的RT-PCR验证,结果表明MaASR1基因异源表达的拟南芥株系在自然生长条件下共有747个差异基因,其中上调基因559个,下调基因188个;在干旱胁迫条件下共得到653个差异基因,其中上调基因256个,下调基因397个;MaASR1基因的转入可以通过影响激素、光合作用、锌指蛋白及不依赖ABA途径的DREB2A等相关基因的表达来提高拟南芥的抗旱性。为解析MaASR1基因作为转录因子提高植物抗旱能力的分子机制奠定基础。     

柠条锦鸡儿香豆酸-3-羟化酶基因克隆及其功能初步研究

香豆酸-3-羟化酶(Coumarate 3-Hydroxylase,C3H)是木质素生物合成途径中的关键酶之一。以柠条锦鸡儿为材料,利用RACE技术克隆了C3H基因。对柠条锦鸡儿C3H基因的gDNA和cDNA全长分析显示该基因具有3个外显子,2个内含子,编码框长度为1530bp,编码509个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点位7.67,分子量约57.61kDa。氨基酸序列分析显示具有一个保守的P450结构域。系统进化分析表明该蛋白与大豆C3H具有最高的同源性,将该基因命名为CkC3H,GeneBank登录号为HQ829858。构建了35S启动子驱动的CkC3H基因植物表达载体,互补拟南芥C3H(CYP98A3)基因突变体ref8,转基因植物表型得以部分恢复。这些结果说明柠条锦鸡儿CkC3H与拟南芥C3H至少具有部分相同的功能。     

柠条锦鸡儿CkLEA1基因克隆及表达分析

植物受到逆境胁迫后,大量逆境响应基因会被诱导表达,LEA蛋白编码基因就是与植物抗旱、抗冷等非生物胁迫密切相关的一类基因。从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一条LEA蛋白编码基因并进行了克隆。序列比对与系统进化分析显示该基因属于LEA3基因家族成员,命名为CkLEA1(GenBank登录号是KC309408)。克隆得到该基因gDNA长469bp,包含两个外显子和一个内含子;cDNA长357bp,包含300bp的开放阅读框,推导编码99个氨基酸的蛋白质。利用荧光定量PCR技术对CkLEA1基因在各种逆境胁迫条件的表达情况进行初步研究表明,CkLEA1受干旱、ABA、冷、热、盐和碱等处理不同程度地诱导,推测其与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫的机制有关。     

野油菜黄单胞菌效应蛋白AvrXccC抑制鞭毛蛋白诱导的植物免疫反应

野油菜黄单胞菌III型分泌效应蛋白AvrXccC在拟南芥rar1突变体上发挥毒性功能,然而,AvrXccC是如何发挥毒性功能的,目前还不清楚。本研究构建了A6vrXccC在rar1突变体上的转基因植株,通过接种DC3000 hrcC突变体,发现AvrXccC/rar1转基因植株可以促进hrcC的毒性功能。进一步研究发现,AvrXccC/rar1转基因植株抑制细菌鞭毛蛋白激发的活性氧爆发、胼胝体沉积及下游NHO1和FRK1基因的表达;但AvrXccC不抑制鞭毛蛋白诱导的MAPK激酶活性。研究表明,AvrXccC抑制植物先天免疫反应可能独立于MAPK信号通路之外,为将来分离AvrXccC在植物体内的毒性靶标奠定了基础。     

唐菖蒲GhMYC2基因启动子的活性分析

以唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种"Rose Supreme"为材料,采用hiTAIL-PCR方法克隆得到GhMYC2基因上游906bp的启动子序列。利用植物顺式作用元件查询数据库PLACE分析发现,GhMYC2启动子序列中不仅含有响应茉莉酸(jasmonate,JA)的元件T/GBOXATPIN2,还含有大量与病原菌诱发因子表达调节相关的转录因子WRKY以及抗性元件W-box、E-box等顺式作用元件。在ProGhMYC2::GUS转基因拟南芥中发现,GhMYC2的表达具有时空特异性,且主要在根、叶中表达。对转基因拟南芥进行茉莉酸甲酯(methyl jasmonic acid,MeJA)和灰霉菌(Botrytis cinerea)处理发现,转基因植株中GUS的表达均上调,表明其表达受到MeJA和灰霉菌的影响,此结果可为研究JAs途径调控植物抵御病害提供一定的参考。     

过量表达拟南芥CAT提高烟草对气体甲醛的吸收和抗性

为提高植物对甲醛的吸收和耐受,利用拟南芥CAT的编码区构建植物过表达载体pk2-Prbc S-*T-CAT,在野生型(WT)烟草叶绿体中过量表达CAT产生2个表达量不同的转基因株系(C1、C3)。用10ppm、20ppm和40ppm气体甲醛处理WT和转基因烟草,分析过量表达CAT的转基因烟草对甲醛的吸收效率和耐受性。结果表明,转基因烟草对气体甲醛的吸收量明显高于WT,且随着处理浓度的升高,转基因株系叶片的可溶性总糖、总蛋白质和总叶绿素含量都显著高于WT;转基因株系叶片氧化损伤指标H202、丙二醛(MDA)和羰基化蛋白(PC)的含量都显著低于野生型。转基因烟草(C1)的PM H+-ATPase和氢泵活性在40ppm处理后为WT的3倍和2.5倍,C1的气孔导度为WT的2.67倍。这些结果表明,在烟草中过量表达拟南芥CAT能降低甲醛进入烟草细胞引起的氧化损伤,提高烟草对甲醛的脱毒能力,增强烟草对甲醛的吸收和抗性。揭示气体甲醛胁迫时质膜H+-ATPase和氢泵活性影响叶片气孔的导度,这可能是转基因烟草甲醛吸收效率提高的原因之一。