稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的c DNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORαc DNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pc DNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pc DNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的c DNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORαmRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

Kiss-1与结肠癌SW480细胞增殖的关系

目的以结肠癌细胞SW480为模型,初步探讨Kiss-1基因过表达与结肠癌细胞增殖的关系。方法采用脂质体转染的方法将Kiss-1/pEGFP-N1重组质粒转染至SW480细胞,上调结肠癌细胞中Kiss-1的表达水平,经G418筛选出稳定表达株;根据细胞分为3组:阴性对照组(转染pEGFP-N1空载体)、实验组(转染pEGFPN1-Kiss1)及空白对照组(未转染)。Western blot检测转染后细胞中Kiss-1表达量的变化;采用CCK8试验分析Kiss-1对SW480细胞增殖的抑制效果。结果成功将pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒转染至SW480结肠癌细胞,western blot检测出阴性对照组和空白对照组中显示Kiss-1低表达,实验组Kiss-1表达量增加,CCK8试验表明实验组细胞增殖率明显低于对照组(P<0.05)。结论 Kiss-1可抑制结肠癌细胞的增殖率。     

ARHI基因与HuR蛋白在胰腺癌PANC-1细胞中的表达

目的观察ARHI基因转染胰腺癌PANC-1细胞后对HuR蛋白的影响。方法采用脂质体法将表达ARHI基因的质粒p LNCX2-ARHI-EGFP和空载体p LNCX2-EGFP转染胰腺癌PANC-1细胞,细胞分为3组:实验组(p LNCX2-ARHIEGFP)、空载体转染组(p LNCX2-EGFP)和PANC-1细胞空白对照组,用G418筛选稳定转染的细胞株;采用PCR和Western blot方法检测ARHI基因表达,采用Western blot方法检测HuR蛋白表达。结果稳定转染ARHI基因组可检测到ARHI基因mRNA和蛋白的表达。根据图像灰度计算蛋白条带相对表达量,稳定转染ARHI基因组HuR蛋白表达(0.2226±0.0644)较空载体对照转染组(0.4063±0.0925,P=0.029)和PANC-1细胞空白对照组(0.4178±0.1319,P=0.022)显著降低。结论 ARHI基因可以导致胰腺癌细胞株中HuR蛋白表达降低。     

URI基因稳定表达对肝癌SMMC-7721细胞增殖能力的影响

目的:瞬转以及筛选出能够稳定表达URI(RPB5-mediating protein)基因的SMMC-7721细胞株,以其为模型研究URI基因对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响。方法:首先,抽提URI的重组质粒并转染到SMMC-7721细胞中,在G418药物的筛选下选出能够稳定表达URI基因的细胞株,RT-PCR法和酶切检测该稳定细胞中URI基因的表达效率以确认URI是否稳定表达,MTT法和克隆形成实验检测URI基因对SMMC-7721细胞增殖的影响。结果:成功建立URI基因过表达的稳定细胞株。与SMMC-7721细胞对照组比较,其URI mRNA表达水平显著上调,能稳定表达URI细胞株的增殖,克隆形成率明显升高。结论:pFLAG-CMV-4-URI重组质粒能使URI在肝癌SMMC-7721细胞内稳定表达,过表达URI基因有可能帮助细胞通过G2/M期检验点来提高肝癌细胞SMMC-7721的增殖能力。     

鼻咽癌基因治疗的实验研究

目的研究Survivin表达下调和p53过表达对鼻咽癌细胞CNE-2的靶向杀伤作用。方法扩增hTERT启动子不同区段,构建真核表达质粒pcDNA3.1-hTERT-Survivin,用于启动Survivin反义寡核苷酸的表达;扩增p53基因,克隆到pcDNA3.1质粒中,构建p53的过表达载体pcDNA3.1-p53;联合pcDNA3.1-hTERT-Survivin和pcDNA3.1-p53转染鼻咽癌细胞株CNE-2,RT-PCR和免疫印迹法检测p53和Survivin的表达情况,MTT法检测CNE-2细胞活率情况,Annexin V/PI双染色法检测共转后的细胞凋亡情况。结果成功扩增270 bp和728 bp 2种不同大小片断的hTERT启动子区域,并与CMV增强子连接,以GFP为报告基因检测发现,270 bp启动子区段能较有效启动基因的表达;进一步成功构建Survivin反义寡核苷酸表达质粒pcDNA3.1-hTERT-Survivin和p53过表达载体pcDNA3.1-p53;转染鼻咽癌细胞株CNE-2后检测表明Survivin表达下调和p53表达上调;MTT和流式细胞检测显示联合转染pcDNA3.1-hTERT-Survivin和pcDNA3.1-p53可诱导鼻咽癌细胞株CNE-2的凋亡。结论利用hTERT启动子和CMV增强子可有效启动Survivin反义寡核苷酸的表达转染鼻咽癌细胞CNE-2后可抑制Survivin的表达,同时联合过表达p53基因后,可以有效诱导鼻咽癌细胞CNE-2的凋亡,提示该方法可以成为有效治疗鼻咽癌的一种新的靶向治疗方法。     

铜绿假单胞菌mexA基因原核表达载体的构建

目的构建mexA基因的原核载体,为进一步表达MexA蛋白奠定基础。方法从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再以PUC/mexA1质粒为模板PCR扩增mexA目的基因,克隆至质粒pQE30中,构建表达质粒pQE30/mexA,构建的表达质粒pQE30/mexA转化大肠杆菌M15,培养后提取纯化重组质粒pQE30/mexA酶切鉴定。结果获得长约1.5 kbPCR mexA1产物,酶切结果显示所构建的重组质粒PUC/mexA1已成功地克隆了mexA1（1.5 kb）基因,序列分析结果与PAO1/mexA1序列相同,构建的表达质粒pQE30/mexA酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因mexA（1.2 kb）片段相符。结论含mexA（1.2 kb）基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达MexA蛋白奠定了基础。     

miR-1腺病毒载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定microRNA-1（miR-1）的腺病毒表达载体。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAdprecusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率。结果基因测序及酶切鉴定证实重组Adprecursor-miR-1腺病毒载体构建成功;腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平。结论利用同源重组的方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达水平。     

高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定

目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型。方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定。构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株。采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化。建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤。结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光。胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型。结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具。     

靶向重组Aif-T18融合蛋白对TEM1阳性肿瘤细胞的杀伤作用的研究

验证Aif-T18融合蛋白对肿瘤内皮细胞标志分子1(TEM1)阳性肿瘤细胞的杀伤作用。采用基因工程技术方法构建重组质粒pIRES-TEM1-EGFP,转染TEM1阴性表达细胞MS1,经G418筛选得到TEM1阳性细胞株(MS1-TEM1);通过构建重组质粒pET302-Aif和pET302-Aif-T18,转化至表达宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导菌体得到所需的目的蛋白,采用流式细胞仪和MTT技术检测融合蛋白对MS1和MS1-TEM1细胞的亲和力和特异性杀伤的效果。本研究中,主要利用单链抗体sc FvT18选择性携带凋亡诱导因子AIF,靶向抑杀TEM1阳性细胞,从而为Aif-T18融合蛋白在肿瘤治疗中的开发应用提供实验依据。     

鼻咽癌相关新基因NPCEDRG突变型重组表达载体的构建及生物信息学分析

目的构建带His标签的突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体。方法以pcDNA3.1-NPCEDRG重组质粒为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增NPCEDRG基因编码区,利用PCR过程中的碱基错配,随机突变产生NPCEDRG的突变体,分别将野生型及突变型NPCEDRG基因编码区cDNA插入pcDNATM3.1/myc-HisB真核表达载体,双酶切鉴定,测序验证,生物信息学方法进行蛋白质结构预测。结果双酶切突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,均产生519 bp长度的目的片断。测序结果证实,突变型NPCEDRG基因有两个点发生了突变,分别是T260-C260和T287-C287,但没有移码突变,在线生物信息学分析结果示其相应氨基酸序列改变为V73-A73和M82-T82;野生型NPCEDRG基因序列与Genebank已知序列一致。两个重组载体插入片段大小均为513 bp,插入方向及位置正确,能表达预期所要的融合蛋白。结论成功构建了带His标签的突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,为深入研究NPCEDRG基因功能和揭示鼻咽癌发病分子机制提供实验手段。     

住宅楼安装中央空调的加固案例分析

文章通过两处住宅用房安装中央空调的事例,现场查勘、验算与鉴定,证实了在住宅用房的混凝土梁上钻孔洞安装中央空调管线的做法,影响了房屋结构的安全,同时给出了加固处理意见,提出了个人的几点看法.     

Regularities of development of settling of models of deep footings

Conclusions 1. The effect of relative penetration on the change in magnitude of settlement is substantial. With the same specific pressure on the base the settlement of the model decreases as the relative penetration increases.2. Published data on values of unit friction forces along lateral surfaces of deep foundations were confirmed. The maximum value of resistance along the side surface was 2 tons/m².3. It was established that the realtionship between the settlement of the model and its diameter is nonlinear. This is of great importance in working out a method for calculating foundations of deep footings from deformations especially if one considers that in this case the foundation carries substantial pressures and deforms under conditions of strongly developed shear regions.Translated from Osnovaniya, Fundamenty i Mekhanika Gruntov, No. 6, pp. 11–12, November–December, 1971.     

测量标志普查资料汇集技术处理

为了适应新的形势发展需要,安徽省国土资源厅已启动新一轮测量标志普查工作。与过去不同,此次普查在资料汇集、调查人员组织、调查资料归档与调用等方面做了较大变革,文章简明阐述了变革后的测量标志普查资料汇集技术处理的过程。     

自动扶梯逆行故障成因与分析

对自动扶梯突然反转而导致逆行故障的类别和成因进行了分析,讨论了逆行速度及症状,分析了逆行概率及风险,并针对逆行提出了一些对策。     

浅析步行街的建筑工效学——上海市吴江路步行街建筑工效学调研

从建筑工效学的角度对上海市吴江路休闲步行街进行了调查研究，根据调查结果，分析了其在建筑工效学上的一些特点与不足之处并进行了探讨，以期对步行街的建筑工效学设计提供准确的参考。     

环境的共鸣--大连水产学院图书馆的设计

本文通过对大连水产学院图书馆的介绍,向人们展示了建筑与环境之间相辅相成,共同作用,引起环境共鸣的原则方法.     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础。不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系。无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化。文章综述了几种有效能评价体系的测定技术。     

混凝土碳化深度的灰色预测

混凝土碳化是导致钢筋混凝土结构耐久性损伤的主要原因之一。为了预测混凝土碳化深度,本文建议采用一种基于灰色系统理论的预测模型,该模型可以根据已知的混凝土碳化序列,较精确地预测未来时刻的碳化深度。文章最后以实例说明了该模型的应用。