重组半胱氨酸脱巯基酶AtLCD的表达、纯化及酶学性质

目的:在重组大肠杆菌中表达重组拟南芥L-半胱氨酸脱巯基酶AtLCD(H2S内源产生关键酶),确定最佳诱导表达和纯化条件,并研究重组酶的酶学性质。方法:对大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-LCD进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,将纯化的目的蛋白AtLCD进行酶学性质的研究。结果:重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.1 mmol/L IPTG,30℃诱导3 h。500mmol/L的咪唑洗脱Ni柱可得较纯的目的蛋白。重组酶性质研究结果表明,酶的最适pH为9.5,最适作用温度为37℃,最适条件下的以L-Cys为底物的米氏常数(Km)为1.572 mmol/L,Vmax为1.52 nmol/mg·min。金属离子Mg2+,Fe3+和EDTA对重组酶的活性有一定的抑制作用,Ba2+、Ca2+和Co2+在一定程度上提高了酶的活性,其中Co2+效果更强。蛋白变性剂SDS和酶抑制剂羟胺也不同程度地抑制了酶的活性。结论:明确了重组AtLCD的酶学性质和最佳诱导表达及纯化条件,为该LCD的深入研究和气体信号分子H2S在植物应答逆境胁迫机制的研究奠定了基础。     

人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。     

L-肉碱对胖头鱥肌肉细胞和草鱼性腺细胞抗氧化功能的调节作用

为研究L-肉碱对胖头鱥Pimephales promelas肌肉细胞(FHM)和草鱼Ctenopharyngodon idellus性腺细胞(GCO)抗氧化酶功能的调节作用,以两种鲤科鱼细胞FHM和GCO为研究对象,在培养基中添加不同浓度的L-肉碱(0、0. 001、0. 01、0. 1、0. 5、1、5 mmol/L)分别孵育FHM细胞6 h、GCO细胞12 h,采用生物化学法和荧光定量PCR法检测L-肉碱对细胞抗氧化酶活性和基因相对表达量的影响。结果表明:0. 01～5 mmol/L L-肉碱组FHM细胞SOD、CAT活性显著高于对照组(P<0. 05),仅5 mmol/L L-肉碱组GCO细胞SOD、CAT、GPX、γ-GCS活性显著高于对照组(P<0. 05);与对照组相比,L-肉碱组FHM细胞Cu Zn-SOD mRNA相对表达水平无显著变化(P>0. 05),0. 5、1、5 mmol/L L-肉碱组GCO细胞Cu ZnSOD mRNA相对表达水平显著上调(P<0. 05); 0. 01～5 mmol/L L-肉碱组FHM细胞CAT mRNA相对表达水平显著上调(P<0. 05),所有L-肉碱组GCO细胞CAT mRNA的相对表达水平显著上调(P<0. 05); 0. 5mmol/L L-肉碱组GCO细胞GPX mRNA相对表达水平显著上调(P <0. 05);仅0. 1 mmol/L L-肉碱处理FHM细胞GCLC mRNA相对表达量水平显著上调(P<0. 05),L-肉碱添加范围为0. 5～5 mmol/L时,GCO细胞GCLC mRNA的相对表达水平均显著上调(P<0. 05)。研究表明,在培养基中添加L-肉碱能明显上调FHM和GCO细胞的抗氧化酶活性及其相关基因的相对表达水平,在本试验条件下,细胞培养基中推荐L-肉碱的适宜添加浓度为0. 1～1 mmol/L。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶(Nm LEH)通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21 (DE3)宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0. 5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高(0. 45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组Nm LEH蛋白;对Nm LEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH为7. 5,在pH 7. 0～9. 0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明Nm LEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

Thermobifida fusca海藻糖合成酶基因的克隆表达及发酵优化

将来源于嗜热单孢菌(Thermobifida fusca)的海藻糖合成酶基因进行克隆表达,构建重组菌E.coli BL 21(DE3){pET-24a(+)/Tres}。并对基因工程菌的发酵产酶条件进行优化,得到最优培养基成分为:甘油12 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨12g/L,磷酸盐浓度60mmol/L,Zn2+2mmol/L。最佳培养条件为:装液量20 ml(250 ml摇瓶),发酵2 h后25℃诱导并添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。优化后的最终发酵酶活达到28.6 U/ml,为未优化前的3.4倍,是目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产海藻糖合成酶的最高表达水平,为该酶的工业化生产奠定了基础。     

重组大肠杆菌产Streptomyces sp.FA1来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化

为了实现来源于Streptomyces sp.FA1的木聚糖酶的高效胞外分泌表达,对E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)/coe/xynA基因工程菌的发酵产酶诱导条件进行优化,获得最优的诱导条件为25℃发酵6 h后添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。在此基础上对发酵培养基进一步优化,得到最优培养基成分为:甘油11 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨8 g/L,磷酸盐浓度89 mmol/L,镁离子4mmol/L。最终酶活达到780.2 U/ml,为未优化前的2.2倍,是目前大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平,为实现该酶的工业化生产奠定基础。     

非对称二甲基精氨酸水解酶的表达纯化及其酶学性质的研究

非对称二甲基精氨酸水解酶(dimethylarginine Dimethylaminohydrolase,DDAH)是酶学循环法检测早期急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)的生物标记物——非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)的重要工具酶。为获得高活性DDAH,从绿脓杆菌的基因组中扩增目的基因,构建高效表达DDAH的重组菌E.coli BL 21(pET-28a-DDAH)。该菌的可溶性DDAH表达量达100mg/L,经超声破碎后的上清液通过镍柱纯化,可获得纯度达到95%以上的重组DDAH。Q柱的精制可提高它的稳定性,使其能够在常温下长期保持酶活。该重组酶的单位酶活,Km值和Vmax分别为0.5U/mg,3.04 mM和8.07mM/h。最适反应温度和pH分别为35℃和pH=6,在10℃～40℃和pH5.0～pH9.0的范围内稳定。该重组酶可形成多聚体,但并不影响酶活。最后,利用发酵罐扩大生产规模,有望进行克级生产,为新型ADMA检测试剂盒的开发和药物筛选模型提供材料基础。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

CASS处理低碳氮比生活污水试验研究

采用CASS工艺对低碳氮比生活污水进行处理研究,试验结果表明：通过外加甲醇将碳氮比调整到5∶1,排水比50%,混合液回流比100%的情况下,最佳运行工况为充水曝气6 h,沉淀1 h,滗水0.5 h,静置0.5 h,在进水COD为210 mg/L-375 mg/L,TN为52 mg/L-62 mg/L,TP为1.9 mg/L-2.9 mg/L,SS为100 mg/L-202 mg/L的情况下,出水COD为5 mg/L-50 mg/L,TN为10 mg/L-21 mg/L,TP为0.5 mg/L-1.2 mg/L,SS为6 mg/L-19 mg/L,出水各项指标稳定且达到排放标准。     

长角血蜱副肌球蛋白的原核表达、纯化与免疫原性分析

为进一步研究长角血蜱副肌球蛋白(paramyosin,Pmy)的免疫保护力,将本实验室构建的重组质粒pET-32(a+)-pmy转入E.coli BL21进行原核表达。SDS-PAGE电泳结果表明,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度为0.5mmol/L、诱导温度为25℃、诱导时间为6h条件下,重组蛋白(rPmy)在菌液上清中的表达量最高,并通过亲和层析法纯化得到rPmy。Western blotting结果表明rPmy具有免疫原性。研究结果可为今后抗蜱疫苗的研制提供理论依据。