一种基于VP6基因的A组轮状病毒拷贝数实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种基于VP6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增VP6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,建立RT-qPCR病毒拷贝数检测方法,以标准品质粒Ct值为横坐标,拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线,依据标准曲线方程检测样品中RV拷贝数。结果标准品质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;获得RV标准品质粒的标准曲线方程为y=-0. 246 3 x+10. 957,R~2=0. 995 5;原倍及稀释度为1×10~(-3)的样品溶液的RV病毒拷贝数分别为265 319. 903 5、1 682. 228 735 copies/μL。结论建立的RT-qPCR拷贝数检测方法,能在早期快速准确的检测RV,该方法稳定性较好,可据此标准曲线方程对样品中的RV进行绝对定量,为RV研究及临床检查提供了检测工具。     

实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻重链基因的拷贝数

目的建立实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻重链基因的拷贝数。方法以分别带有抗体轻链和重链的质粒作为标准品,进行实时定量PCR反应,建立标准曲线。提取转染抗体轻重链基因的CHO细胞基因组DNA,进行定量PCR反应,通过标准曲线,再根据10 ng CHO基因组中含有的单拷贝基因的数量,分别计算得到抗体的轻链和重链基因在CHO细胞中的拷贝数。结果分别建立了抗体轻链和重链基因的拷贝数标准曲线,标准曲线的相关系数均在0.99以上,PCR扩增效率分别为91.6%和91.8%,具有良好的特异性。随着细胞培养代次的增加,轻链基因和重链基因的拷贝数均出现降低的现象。结论成功建立了实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻链和重链基因的拷贝数,可用于外源抗体基因在CHO细胞中的遗传稳定性研究,也为高表达细胞株的获得提供了一种检测方法。     

登革病毒Ⅰ型拷贝数标准质粒和检测体系的建立及其应用

目的建立登革病毒Ⅰ型(dengue virus-Ⅰ,DENV-Ⅰ)拷贝数标准质粒及其检测体系。方法将DENV-Ⅰ的前膜蛋白基因克隆至pMD19-T载体,建立DENV-Ⅰ标准质粒,采用实时荧光定量PCR法进行扩增,获得Ct值与病毒拷贝数的关系,绘制标准曲线,得到相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及检测体系对3份2017年云南西双版纳DENV-Ⅰ患者的血清进行检测。结果经双酶切及测序鉴定,DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒构建正确。实时荧光定量PCR得到的标准曲线方程为y=-0. 300 5 x+12. 133,R~2=0. 991 9。3份血清样品原液的病毒拷贝数分别为9 417 703. 12、21 949 591. 01及19 027 096. 91 copies/μL。结论成功建立了DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒及其检测体系,且准确性较好,灵敏度较高,可用于血清样品中DENV-Ⅰ拷贝数的检测。     

单启动子双拷贝CPC酰化酶基因在毕赤酵母中的表达

为了实现外源基因在毕赤酵母中的高效表达,以口蹄疫病毒的2A片段连接2个头孢菌素C (CPC)酰化酶基因,形成双顺反子结构的质粒,整合到毕赤酵母的基因组中,并以筛选标记和聚合酶链式反应进行验证,最终得到双拷贝的阳性重组子. 通过摇瓶发酵培养,双拷贝转化菌株的最高酶活为2810 U/L,而在相同菌体浓度下,双拷贝转化菌株的CPC酰化酶酶活为单拷贝转化菌株的1.6倍. 利用结构短小和高剪切效率的2A多肽,不但可达到单启动子调控多份基因的目标,也为真核表达系统中以基因的拷贝数增强外源蛋白的表达提供了简便且高效的思路.     

拷贝数对毕赤酵母重组菌表达猪胰岛素前体的影响

通过5 L发酵罐补料分批培养,分析了猪胰岛素前体(PIP)基因拷贝数对毕赤酵母生长、细胞存活率和基因稳定性的影响.结果表明,在甘油阶段和甲醇诱导初期拷贝数对毕赤酵母的生长无显著影响,但在甲醇诱导24 h后高拷贝数毕赤酵母菌株(12拷贝重组菌A2和18拷贝重组菌A3)的比生长速率明显比低拷贝数菌株(1拷贝重组菌G1和6拷...     

鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)BF1和BF2基因实时荧光定量PCR[Real-time fluorescent quantitative(FQ)-PCR]检测方法。方法从鸡外周血淋巴白细胞(Peripheral blood leuk-ocytes,PBLs)中提取细胞总RNA,以其为模板,根据BF1、BF2和GAPDH基因相对保守序列各设计一对引物,应用RT-PCR法扩增目的基因,分别克隆至pGM-T载体上,制备重组质粒标准品,经PCR、EcoRⅠ酶切及测序鉴定;优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立Real-time FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。结果重组质粒标准品经PCR、酶切及测序鉴定构建正确;建立的定量标准曲线临界循环数(Threshold cycle,Ct)与BF1、BF2和GAPDH起始质粒DNA拷贝数的对数之间线性关系良好,相关系数分别为1.00、0.98、0.99,扩增效率分别为0.8、1.1、1.1;该方法的敏感性可达101copies/μl;融解曲线分析表明扩增效率一致,特异性较好;质粒DNA标准品3次检测的CV值误差不超过0.5,均小于5%。结论已成功建立了鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法,为下一步应用该法检测BF1和BF2基因的转录水平奠定了基础。     

诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的分泌表达

目的探讨诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在毕赤酵母表达系统中分泌表达的可行性。方法用pPICZa-A表达载体和X-33毕赤酵母株进行NoV GⅡ.4和GⅡ.17型VP1蛋白的分泌表达,并对阳性菌株进行Mut表型筛选。同时优化起始pH(5.0、6.0、7.0、8.0)、甲醇终浓度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)及发酵时间(24、48、72、96、120 h)3个表达条件。取原始及传代10代菌株,采用优化条件进行发酵,于诱导0～60 h间,通过双标准曲线实时荧光定量PCR法测定外源基因拷贝数。发酵产物经蔗糖密度梯度离心纯化后,检测其浓度及纯度,并观察VLP的形态。结果表达目的蛋白的重组酵母菌株均为Mut~+型。最佳发酵pH为7.0,甲醇终浓度为1%,发酵时间为72 h。菌株传代后未发生基因缺失,整合基因在10代内稳定性良好。GⅡ.4及GⅡ.17型VP1纯度均约85%,浓度分别为133和165μg/mL,VP1蛋白均可自发组装成直径约40 nm的VLP颗粒,形态与天然病毒相似。结论用毕赤酵母表达系统进行NoV VP1蛋白VLP分泌表达是可行的。     

长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R~2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%～101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCK细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%～2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R~2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。     

人干扰素诱导跨膜蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立人干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank中登录的人IFITM1、2、3及β-actin基因序列,分别设计4对特异性引物,以质粒pVAX1-IFITM1、2、3和pMD18-T-β-actin为模板,分别进行PCR及实时荧光定量PCR扩增,优化实时荧光定量PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线及扩增曲线,建立实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的重复性、灵敏度及特异性。结果各质粒的PCR及实时荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见大小与理论值相符的特异性条带。IFITM1、2、3和β-actin的最佳荧光定量PCR引物浓度分别为0.2、0.5、0.4和0.5μl,最佳退火温度为55℃。各质粒标准曲线的循环数与起始模板拷贝数的相关性均较好(R2分别为0.998、0.990、0.990和0.995),扩增效率分别为106.284%、101.030%、104.929%和101.962%。IFITM1、2、3基因不同拷贝数的试验内CV为0.14%-0.72%,试验间CV为0.77%-1.58%;灵敏度分别为2.52×100、1.3×100和3.7×101copies;该方法未扩增出鸡肝脏及禽流感病毒H3N2 cDNA,可特异性扩增B型流感病毒cDNA,各标准质粒的溶解曲线约在同一温度出现1个单峰。结论已成功建立了IFITM1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有较高的重复性、灵敏度及特异性,为进一步研究IFITM1、2、3的功能及其基因表达与肿瘤发生发展的相关性奠定了基础。     

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响

目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。     

Selection of Suitable Endogenous Reference Genes for Relative Copy Number Detection in Sugarcane

Transgene copy number has a great impact on the expression level and stability of exogenous gene in transgenic plants. Proper selection of endogenous reference genes is necessary for detection of genetic components in genetically modification (GM) crops by quantitative real-time PCR (qPCR) or by qualitative PCR approach, especially in sugarcane with polyploid and aneuploid genomic structure. qPCR technique has been widely accepted as an accurate, time-saving method on determination of copy numbers in transgenic plants and on detection of genetically modified plants to meet the regulatory and legislative requirement. In this study, to find a suitable endogenous reference gene and its real-time PCR assay for sugarcane (Saccharum spp. hybrids) DNA content quantification, we evaluated a set of potential “single copy” genes including P4H, APRT, ENOL, CYC, TST and PRR, through qualitative PCR and absolute quantitative PCR. Based on copy number comparisons among different sugarcane genotypes, including five S. officinarum, one S. spontaneum and two S. spp. hybrids, these endogenous genes fell into three groups: ENOL-3—high copy number group, TST-1 and PRR-1—medium copy number group, P4H-1, APRT-2 and CYC-2—low copy number group. Among these tested genes, P4H, APRT and CYC were the most stable, while ENOL and TST were the least stable across different sugarcane genotypes. Therefore, three primer pairs of P4H-3, APRT-2 and CYC-2 were then selected as the suitable reference gene primer pairs for sugarcane. The test of multi-target reference genes revealed that the APRT gene was a specific amplicon, suggesting this gene is the most suitable to be used as an endogenous reference target for sugarcane DNA content quantification. These results should be helpful for establishing accurate and reliable qualitative and quantitative PCR analysis of GM sugarcane.     

重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用

目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%～30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%～50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。     

白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建白细胞介素-10(IL-10)基因多拷贝表达盒,提高IL-10在毕赤酵母中的表达水平。方法体外构建重组表达载体αIL-10/pAO815,BamHⅠ和BglⅡ双酶切获得目的基因表达盒(AOX-αIL-10),再连接到BglⅡ酶切位点处,依次构建多拷贝重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815。从质粒pPIC9K上用NdeⅠ和SalⅠ双酶切获得Kan抗性基因,重组到多拷贝表达载体n(AOX-αIL-10)/pAO815上。重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815电转化毕赤酵母,PCR筛选含有IL-10基因的酵母转化子,甲醇诱导表达,对表达量高的转化子再次经重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan电转化,高浓度G418抗性筛选二次酵母转化子,使用甲醇诱导表达。ELISA测定IL-10含量,MC/9细胞测定IL-10活性。结果所构建的8拷贝表达盒的重组载体8(AOX-αIL-10)/pAO815和4拷贝表达盒4(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan,转化子分泌表达IL-10水平最高,为(8.25±1.65)mg/L,比活性为1.465×105U/mg。结论已成功构建了高拷贝表达盒,并提高了IL-10在毕赤酵母中的表达水平。     

腺病毒载体介导gag基因在小鼠体内的生物分布

目的研究腺病毒载体介导gag基因在C57BL/6小鼠体内的生物分布。方法经C57BL/6小鼠左后肢股四头肌部位单次注射0.05ml Ad-gag,于给药后不同时间摘取组织脏器,采用Taqman探针实时荧光定量PCR法,以小鼠β-actin基因作为内参,外标绝对定量法分别定量样本中gag和β-actin基因拷贝数。计算每104个小鼠细胞中gag基因的拷贝数,比较各脏器的分布数量。结果外标绝对定量法精密性良好。gag基因主要分布在注射位点、淋巴结、脾脏和肝脏,其他脏器没有分布。给药后3d,gag基因在靶器官分布达峰值,注射位点分布最多,伴随时间延长逐渐减少。结论Ad-gag疫苗在体内不会蓄积并产生全身的特别是生殖系统毒性。本研究可作为重要的安全性试验数据,支持药物在临床应用。     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。