HIV-1 HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta(tB41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-ta(tB41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta(tB41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta(tB41-101N)构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta(tB41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta(tB41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。     

融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA的原核表达、纯化及其生物学活性

目的原核表达、纯化融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA,并检测其生物学活性。方法以pET32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增OD序列中的第1-87 bp和第190-216 bp序列,并通过重叠PCR连接成为新序列,命名为OD1,克隆至pET32a(+)载体,构建原核表达质粒pET32a(+)CTP-OD1-HA;再分别以pET32a(+)CTP-OD-HA和pET32a(+)CTP-OD1-HA质粒为模板,PCR扩增CTP-OD-HA和CTP-OD1-HA片段,分别克隆至表达载体pCOLDTF-DNA,构建质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达TF-CTPOD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白;表达的融合蛋白经镍离子亲和层析纯化和脱盐浓缩后,采用MTT法和DAPI染色检测两种融合蛋白对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。结果重组原核表达质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白相对分子质量分别约为67 000和63 000,主要为可溶性表达,表达量分别占总菌体蛋白的35%和20%,脱盐浓缩后,纯度分别约为98%和95%,均可与鼠抗HA单克隆抗体特异性结合;TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA对K562细胞的增殖抑制率分别为34%和31%,与PBS对照组比较,差异有统计学意义(P0.001);TF-CTP-OD-HA和TFCTP-OD1-HA处理的K562细胞胞核均具有细胞凋亡的典型特征。结论原核表达并纯化了TF-CTP-OD1-HA融合蛋白,该蛋白具有与TF-CTP-OD-HA相似的生物学活性,为今后开发治疗慢性粒细胞白血病的小分子多肽药物提供了新的策略。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2(ATP-dependent Clp regulatory subunit C2,ClpC2)基因的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ClpC2基因,插入表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-ClpC2,经双酶切及测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-ClpC2,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpC2蛋白的生物学功能奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

猪干扰素γ的原核表达及抗血清的制备

目的原核表达猪干扰素γ(poIFNγ),并制备其抗血清。方法PCR扩增poIFNγ成熟多肽基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-poIFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价。结果重组原核表达质粒pET-28a-poIFNγ经双酶切和测序证明构建正确;重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达90%;制备的抗血清效价可达10-5。结论已成功地在大肠杆菌中表达了poIFNγ,并制备了较高效价的抗血清。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

链霉菌FJS31-2 abxR2基因克隆表达及蛋白纯化

利用原核表达系统获得链霉菌FJS31-2 AbxR2重组蛋白,并进行纯化。通过PCR扩增abxR2基因,将扩增产物克隆至pET32a质粒上构建重组质粒pET32a-abxR2;将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达,并通过尿素洗涤方式对AbxR2重组蛋白进行纯化。酶切和测序结果均证实重组质粒pET32a-abxR2构建成功;在菌液OD₆₀₀值为0.6、28℃、110 r·min^-1、1.0 mmol·L^-1 IPTG诱导4 h时,AbxR2重组蛋白的表达效果较好;采用尿素洗涤方式纯化AbxR2重组蛋白,可得到单一特异蛋白条带,效果较好。为研究AbxR2蛋白的结构和功能及提高Zunyimycins产量奠定了基础。     

X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。     

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白。方法利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100%;SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43000,表达量占菌体总蛋白的20%以上;Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合。结论已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料。     

HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

通过双酶切、连接、转化等方法将肝靶向穿膜肽-家蝇天蚕素（HTPP-MDC）融合基因克隆至原核表达载体pET32a（＋）上,构建重组表达质粒HTPP-MDC/pET32a。重组质粒转化E.coli BL21（DE3）后,以IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明重组融合蛋白得到了可溶性表达,Western blot杂交证实了表达蛋白的抗原活性。为HTPP-MDC的生物学活性研究及产业化开发奠定了基础。     

进化免疫球蛋白结合分子LD5的原核表达、纯化及结合活性

目的对新型进化免疫球蛋白(Ig)结合分子LD5进行原核表达和纯化,并鉴定其结合活性。方法将LD5基因片段克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌后,IPTG诱导表达。以8mol/L尿素裂解菌体后,上清经Ni2+-NTA柱纯化,并对纯化蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。以ELISA和Dot blot对LD5蛋白结合IgG、IgM活性进行鉴定。结果LD5分子在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白相对分子质量为59000。Western blot表明纯化的LD5蛋白能特异结合IgG。ELISA结果显示,LD5在结合IgM上较SpA具有明显的优势。结论LD5分子在大肠杆菌中已成功表达,纯化的LD5蛋白保留了天然Ig结合分子的结合活性。     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

人HSP70与MAGE-4表位基因原核表达载体的构建及表达

目的构建热休克蛋白70(HSP70)与黑色素瘤抗原-4(MAGE-4)抗原表位基因的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法在热应激条件下,用PCR法从结肠腺癌细胞获取HSP70基因。在线用蛋白质二级结构预测软件分析MAGE-4抗原表位,PCR获取MAGE-4抗原特征表位基因。将二者分别克隆入pGEM-Teasy载体,酶切鉴定后,将HSP70基因亚克隆入pET28a原核表达载体,再将MAGE-4基因克隆入HSP70基因的下游,构建重组质粒pET28a-HSP70-MAGE-4。转化大肠杆菌,IPTG诱导表达并鉴定。结果所构建的HSP70与MAGE-4抗原表位基因表达载体pET28a-HSP70-MAGE-4,经PCR及DNA测序结果表明构建正确。SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带。结论已成功构建了人HSP70与MAGE-4抗原表位基因的原核表达载体,为疫苗研究提供了依据。     

HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。