Kozak序列对TIMP1基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响

目的探讨Kozak序列对基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响。方法构建pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K(含有Kozak序列)重组真核表达质粒,用FugeneHD转染试剂将重组表达质粒转染MCF-7细胞,采用荧光定量PCR和Western blot检测pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K在MCF-7细胞中表达的差异。结果重组真核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。质粒pcDNA3.1-TIMP1-K转染细胞比空白对照细胞TIMP1基因mRNA表达量高约0.95倍,蛋白表达量高0.43倍;而质粒pcDNA3.1-TIMP1转染细胞比空白对照细胞mRNA表达量高0.37倍,蛋白表达量高0.25倍。结论质粒pcDNA3.1-TIMP1-K与pcDNA3.1-TIMP1在MCF-7细胞中mRNA和蛋白表达水平均存在差异,Kozak序列提高了TIMP1基因的表达。     

重组质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的构建及其表达

目的构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70,并筛选稳定表达Her2蛋白的细胞株。方法采用RT-PCR法扩增人乳腺癌SKBR-3细胞中Her2和hsp70基因,插入质粒pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70,经双酶切后,回收hsp70基因,连接入质粒pcDNA3.1-Her2的N-末端,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70。将质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-Her2-hsp70分别转染小鼠乳腺癌4T-1细胞,采用Western blot法检测Her2蛋白的表达。结果重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70经双酶切鉴定,证明构建;转染质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的4T-1细胞中可见相对分子质量约65 000的Her2蛋白的表达。结论已成功构建了重组质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70,并获得了稳定表达Her2蛋白的小鼠乳腺癌4T-1细胞,为进一步探讨佐剂辅助异种抗原产生的抗肿瘤免疫效应奠定了基础。     

bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株的建立

目的建立bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株。方法从CHO细胞中提取总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法扩增bcl-2基因,克隆入pcDNA3.1载体中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-bcl-2。利用脂质体转染法转染CHO-dhfr-细胞,用硫酸新霉素筛选阳性克隆,命名为CHO-G6细胞。通过流式细胞术检测bcl-2基因的表达及细胞凋亡水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果CHO-G6细胞bcl-2基因表达阳性率(92.46%)明显高于CHO-dhfr-细胞(76.08%);CHO-G6细胞的凋亡率(1%)明显低于CHO-dhfr-细胞(19%);在无血清培养基中培养1～5d,CHO-G6细胞的增殖活力均明显高于CHO-dhfr-细胞。结论已成功构建了表达bcl-2基因并具有一定抗凋亡能力的重组CHO细胞株,为进一步应用该细胞株生产重组蛋白奠定了基础。     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

过表达BRIT1基因对鼻咽癌HNE-1细胞凋亡的影响及其机制

目的研究BRIT1(BRCT-repeat inhibitorof h TER expression)基因对鼻咽癌HNE-1细胞凋亡的影响,并初步探讨其相关的分子机制。方法利用免疫组织化学法检测30份鼻咽癌组织及30份鼻咽正常组织中BRIT1蛋白的表达;利用质粒pc DNA3.1(-)/BRIT1及pc DNA3.1转染HNE-1细胞,TUNEL法、Hoechst33342染色法及流式细胞术检测细胞的凋亡情况,Western blot法检测转染细胞中BRIT1蛋白及caspase-3、active caspase-3、Bax、bcl-2蛋白的表达。结果 BRIT1在鼻咽癌组织中的BRIT1蛋白表达水平低于鼻咽正常组织(P0.05);转染质粒pc DNA3.1(-)/BRIT1的HNE-1细胞中,BRIT1蛋白水平明显上调(P0.05);过表达BRIT1明显促进HNE-1细胞的凋亡,并导致抗凋亡蛋白caspase-3、bcl-2表达下调(P0.05),促凋亡蛋白active caspase-3、Bax表达上调(P0.05)。结论BRIT1基因通过调控线粒体凋亡途径相关基因的表达,促进鼻咽癌细胞HNE-1凋亡的发生。     

P4HB基因真核表达质粒的构建及在人肺腺癌A549细胞中的表达

目的构建人P4HB基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从正常人肝细胞HL7702中扩增P4HB基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染A549细胞,通过G418加压筛选,建立稳定转染细胞系,通过qPCR和Western blot法检测转染细胞中P4HB基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB经双酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)和测序证实构建正确;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB基因mRNA的水平为空载体转染的细胞和未转染细胞的102倍;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB蛋白的表达量(1.71)较未转染的A549细胞(1.11)明显升高。结论成功构建了P4HB基因真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,转染A549细胞后,P4HB基因在mRNA水平和蛋白水平均出现了较强的表达,表明P4HB基因已稳定转染入A549细胞中。本实验为进一步研究P4HB对人肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响奠定了基础。     

骨桥蛋白反义基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附能力的影响

目的探讨骨桥蛋白反义基因(ANOPN)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附能力的影响。方法构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3.1-ANOPN,将质粒pcDNA3.1-ANOPN、空载体pcDNA3.1(+)和脂质体分别转染MDA-MB-231细胞,将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-vect和MDA。RT-PCR法检测转染细胞OPN基因mRNA的转录水平,MTT法检测转染细胞的黏附能力。结果重组质粒pcDNA3.1-ANOPN经双酶切、PCR及测序鉴定,证明构建正确。MDA-ANOPN细胞中OPN基因mRNA的转录水平较MDA-vect和MDA细胞明显下降,细胞的黏附能力也明显降低。结论ANOPN可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的黏附。     

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。方法采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数。结果FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高。结论已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。     

塞来昔布对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力、VEGF表达及放疗敏感性的影响

目的探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布(Celecoxib)对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力、血管内皮生长因子(VEGF)表达及放疗敏感性的影响。方法HNE-1细胞经不同浓度塞来昔布处理后,采用MTT法检测各组细胞的增殖水平,细胞侵袭试验检测细胞的侵袭转移能力,RT-PCR及ELISA分别检测细胞VEGF mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,克隆形成试验检测细胞对放疗的敏感性。结果不同浓度的塞来昔布均可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力,并显著下调HNE-1细胞VEGF在mRNA及蛋白水平的表达,且均呈剂量依赖性,差异具有统计学意义。克隆形成试验结果表明,125μmol/L的塞来昔布与放疗联用对HNE-1细胞有明显的协同抗肿瘤效应。结论塞来昔布对HNE-1细胞的增殖与侵袭能力及VEGF的表达均有明显的抑制作用;经塞来昔布处理可增强HNE-1细胞对放疗的敏感性。     

人周期素依赖性激酶10真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建人周期素依赖性激酶10(cyclin-dependent kinase 10,CDK10)真核表达质粒,并进行鉴定。方法采用RT-PCR法从人鼻咽癌细胞株HNE1中扩增CDK10基因全长编码区序列,克隆入真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pc DNA-CDK10,转染人鼻咽癌细胞株CNE-2,采用Western blot法检测转染细胞中CDK10蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pc DNA-CDK10经双酶切及测序证实构建正确;经800μg/ml的G418筛选2周后,获得过表达CDK10的稳定转染细胞系CDK10c1和CDK10c2;与空载体转染对照组相比,CDK10c1和CDK10c2细胞中CDK10蛋白的表达量均显著升高(P均0.05)。结论成功构建了人CDK10真核表达质粒。     

重组肺癌抑癌基因1蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的表达、纯化重组人肺癌抑癌基因1(Tumorsuppressor in lung cancer1,TSLC1)蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用RT-PCR法扩增TSLC1基因全长编码区序列,克隆入原核表达质粒pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,免疫家兔,ProteinA亲和层析纯化抗血清,并经Westernblot分析其反应原性。结果重组表达质粒pQE30-TSLC1经双酶切及测序鉴定证明构建正确。重组TSLC1蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14%,主要以包涵体形式存在。纯化的重组蛋白纯度为93.4%,可与小鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应。以其制备的多克隆抗体具有良好的抗原识别特异性。结论已成功制备TSLC1多克隆抗体,为深入研究TSLC1分子的生物学活性奠定了基础。     

小鼠Chk1基因RNAi表达质粒的构建与筛选

目的构建并筛选小鼠细胞周期检测点激酶1(Chk1)基因的RNAi表达质粒,为肿瘤的基因治疗探索新途径。方法根据GenBank中登录的Chk1基因序列及shRNA设计原则,设计、合成用于构建Chk1基因RNAi质粒的寡核苷酸,并构建4种重组Chk1RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体LipofectamineTM2000介导转染小鼠Lewis肺癌细胞株。转染后48h,采用RT-PCR技术检测转染细胞中Chk1基因mRNA的转录水平,筛选有效的Chk1RNAi质粒。结果4种重组Chk1RNAi质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确。转染后48h,转染质粒pGPU6/GFP/Neo-Chk1-536的Lewis细胞Chk1基因mRNA的转录水平下降,以其作为后续实验的有效质粒。结论已成功构建并筛选出Chk1基因的iRNA表达质粒,为Chk1基因iRNA治疗肿瘤的研究奠定了基础。     

Atorvastatin Attenuates Programmed Death Ligand-1 (PD-L1) Induction in Human Hepatocellular Carcinoma Cells

Liver cancer is the sixth most common cancer worldwide with high morbidity and mortality. Programmed death ligand 1 (PD-L1) is a major ligand of programmed death 1 receptor (PD1), and PD1/PD-L1 checkpoint acts as a negative regulator of the immune system. Cancers evade the host’s immune defense via PD-L1 expression. This study aimed to investigate the effects of tumor-related cytokines, interferon gamma (IFNγ), and tumor necrosis factor alpha (TNFα) on PD-L1 expression in human hepatocellular carcinoma cells, HepG2. Furthermore, as atorvastatin, a cholesterol-lowering agent, is documented for its immunomodulatory properties, its effect on PD-L1 expression was investigated. In this study, through real-time RT-PCR, Western blot, and immunocytochemistry methods, PD-L1 expression in both mRNA and protein levels was found to be synergistically upregulated in HepG2 by a combination of IFNγ and TNFα, and STAT1 activation was mainly responsible for that synergistic effect. Next, atorvastatin can inhibit the induction of PD-L1 by either IFNγ alone or IFNγ/TNFα combination treatment in HepG2 cells. In conclusion, in HepG2 cells, expression of PD-L1 was augmented by cytokines in the tumor microenvironment, and the effect of atorvastatin on tumor immune response through inhibition of PD-L1 induction should be taken into consideration in cancer patients who have been prescribed atorvastatin.     

人Rac1基因shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Rac1基因shRNA表达质粒,为提高卵巢癌放化疗的敏感性奠定基础。方法根据GenBank中登录的人Rac1基因序列,应用shRNA设计软件设计并合成用于构建shRNA表达质粒的oligo DNA,构建shRNA重组质粒。将阳性Rac1基因shRNA重组质粒经脂质体介导转染卵巢癌Skov3细胞,48 h后经RT-PCR筛选有效的shRNA重组质粒。结果经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ酶切鉴定出阳性Rac1基因shRNA重组质粒,序列比对分析结果与理论序列完全一致。RT-PCR检测显示,转染pGPU6/GFP/Rac1-524的Skov3细胞Rac1基因mRNA的转录水平下降。结论已成功构建人Rac1基因shRNA表达质粒,并筛选出有效的干扰质粒pGPU6/GFP/Rac1-524。     

人黏蛋白1串联重复区基因真核表达载体的构建及其在动物细胞中的表达

目的构建人黏蛋白1串联重复区(MUC1 VNTR)17重复序列肿瘤抗原真核表达载体,并在COS-7、HeLa和Lewis细胞中表达。方法设计1对分别含SalⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,PCR法合成1重复MUC1 VNTR片段,克隆入pGEM-Teasy载体,依据SalⅠ和XhoⅠ酶切产生相同黏性末端的特性,依次连接,构建17重复MUC1 VNTR(17m),再亚克隆至VR1012真核表达载体,构建真核表达质粒VR1012-17m。分别转染COS-7、HeLa和Lewis细胞,并进行检测。结果酶切鉴定和序列分析证实,构建的重组质粒含17m序列,经转染的COS-7、HeLa和Lewis细胞,RT-PCR检测均有17m mRNA转录,Western blot检测均有17m蛋白的表达,并与MUC1 VNTR单抗产生特异性反应。结论已成功构建17m肿瘤抗原真核表达载体,并在COS-7、HeLa和Lewis细胞中得到表达,可用于MUC1疫苗和肿瘤生物学治疗的进一步研究。     

L-Type Amino Acid Transporter 1 Regulates Cancer Stemness and the Expression of Programmed Cell Death 1 Ligand 1 in Lung Cancer Cells

The l-type amino acid transporter 1 (LAT1) is a membranous transporter that transports neutral amino acids for cells and is dysregulated in various types of cancer. Here, we first observed increased LAT1 expression in pemetrexed-resistant non-small cell lung cancer (NSCLC) cells with high cancer stem cell (CSC) activity, and its mRNA expression level was associated with shorter overall survival in the lung adenocarcinoma dataset of the Cancer Genome Atlas database. The inhibition of LAT1 by a small molecule inhibitor, JPH203, or by RNA interference led to a significant reduction in tumorsphere formation and the downregulation of several cancer stemness genes in NSCLC cells through decreased AKT serine/threonine kinase (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR) activation. The treatment of the cell-permeable leucine derivative promoted AKT/mTOR phosphorylation and reversed the inhibitory effect of JPH203 in the reduction of CSC activity in pemetrexed-resistant lung cancer cells. Furthermore, we observed that LAT1 silencing caused the downregulation of programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) on lung cancer cells. The PD-L1⁺/LAT1⁺ subpopulation of NSCLC cells displayed great CSC activity with increased expression of several cancer stemness genes. These data suggest that LAT1 inhibitors can serve as anti-CSC agents and could be used in combination with immune checkpoint inhibitors in lung cancer therapy.     

转化生长因子-β1基因shRNA表达质粒的构建及其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响

目的构建转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)基因短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响。方法设计并合成2对靶向TGF-β1基因的RNA干扰序列和1对阴性对照序列,并构建重组表达质粒pshRNA-TGF-β1a、pshRNA-TGF-β1b和pshRNA-TGF-β1c(阴性对照),以脂质体介导转染SW480细胞,荧光显微镜观察转染情况;RT-PCR和Western blot检测转染细胞中TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;Transwell侵袭试验检测沉默TGF-β1基因表达对细胞侵袭能力的影响。结果 TGF-β1基因shRNA重组表达质粒经酶切鉴定和测序分析证明构建正确。与空白对照组相比,3种质粒转染的细胞均有较强的荧光表达;pshRNA-TGF-β1a和pshRNA-TGF-β1b组细胞TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显减低(P<0.05);SW480细胞的侵袭能力也明显降低(P<0.05)。结论成功构建了TGF-β1基因shRNA重组表达质粒,其能有效抑制结肠癌细胞SW480中TGF-β1基因的表达,并可显著降低细胞的侵袭能力,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。     

腺病毒5型E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响

目的探讨E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响。方法双酶切质粒pUC119-E1A,获得E1A基因,连接入pEGFP-C1载体,构建真核表达质粒pEGFP-E1A。经脂质体介导转染人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株,经筛选获得稳定表达E1A基因的转染细胞。RT-PCR检测E1A基因的mRNA转录水平。体外观察各组细胞软琼脂集落及对抗肿瘤药物顺铂的敏感性。结果RT-PCR结果显示,只有重组质粒pEGFP-E1A转染的细胞在约380 bp处有一特异性扩增条带,与未转染组和空载体转染组相比,转染E1A基因后,SK-BR-3肿瘤细胞在软琼脂中形成的集落明显变小,集落形成率明显降低,对顺铂的敏感性明显提高。结论已成功构建E1A基因表达质粒,并稳定表达了E1A基因,表达产物明显抑制乳腺癌细胞的生长,有效提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为其临床应用提供了理论和实验依据。     

X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。